彭興 1 ，朱曼潔 1 ，李春麗 1 ，蘆苓 2
1. 賽默飛世爾科技（中國）有限公司 ；2.Thermo Fisher Scientifc, Liverpool, UK

摘 要
本研究利用氣相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（Thermo Scientific TM Q Exactive-GC）建立了435種農藥
化合物精確質量數據庫，并結合相應的數據處理軟件，在此基礎上建立了農藥多殘留快速篩查流程。實驗對檢索中所
需的各項參數進行了優(yōu)化，用以提高篩查準確度，避免假陽性和假陰性結果的產生。實驗結果表明，在實際樣品檢
測中，分辨率60,000 FWHM（200 m/z）及以上， 質量準確度 < 2.0 ppm，篩查準確度會有大大改善。同時仍然可以保
持高靈敏度，完全滿足食品中農藥殘留檢測要求。篩查方法同時使用了精確質量數和偏差，保留時間窗口，同位素分布與同位素豐度信息等參數，進而獲得快速、準確的結果。

關鍵詞 Q Exactive-GC；精確質量數據庫；農藥多殘留

1.引言
農產品作為人們日常生活中必不可少的食品，其日常消費量和市場需求量巨大，目前，全球有超過 1100 種農藥應用于農業(yè)生產中[1] 。為提高農產品的產量，改善其品質，施用農藥不可避免，加之農藥的濫用及亂用現象，這不僅使得果蔬中農藥殘留超標，并且加重了農藥對環(huán)境的污染，同時對國際貿易及消費者的健康造成不良影響。為了應對這次問題，許多國家和國際組織都發(fā)布了農藥的最大殘留限量（MRLs），對不同基質中的不同農藥殘留進行了嚴格的規(guī)定[2]。我國GB2763-2014《食品中農藥最大殘留限量》也規(guī)定了387種農藥的3650項MRLs（GB 2763-2014）[3]。果蔬中農藥殘留問題，不僅成為食品安全領域面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，而且也制約了我國果蔬產品的進出口貿易。

農藥的痕量多殘留檢測，一直是農藥殘留分析的研究重點和發(fā)展趨勢，是分析化學工作者追求的目標。目前，全世界在用農藥加之其代謝物、同分異構體和降解產物可達幾千種，這就決定了農藥分析的復雜性和多樣性�？焖佟�準確的農藥多殘留檢測方法已成為國內及國際上的重點研究方向。

目前，常用的農殘篩查多用串接氣質或者串接液質檢測來實現。串接質譜由于其靈敏度高、特異性強，因而被廣泛得應用在食品及農產品中的多殘留分析檢測中。但是，隨著樣品基質越來越復雜, 農藥檢測數目的增加以及痕量分析的要求，三重四極桿質譜一般采用多反應監(jiān)測（MRM）的掃描模式，由于其固定目標化合物，帶有一定的局限性。四極桿-飛行時間質譜（Q-TOF）和靜電場軌道阱高分辨質譜（Orbitrap）采用高分辨全掃描的方式（無限制目標化合物）在很大程度上彌補了這個缺陷，被廣泛應用于農藥殘留的快速篩查。

對于高分辨選擇性上，只有當分辨率高于 50,000 時，高分辨全掃描方式的選擇性才會體現出好于三重四極桿質譜MRM 的掃描模式，即交叉點 [4] 。因此在樣品篩查分析過程中，Q Exactive-GC高分辨質譜參數選擇了 60,000（ m/z  200）以上的分辨率，大大提高了農藥殘留定性篩查的速度和結果的可靠性，同時獲得更準確的定量結果。

Q Exactive - GC，作為一款氣質高分辨產品，基于 Orbitrap 靜電場軌道阱技術獨特的高分辨率和高質量精度測定原理以及優(yōu)良的穩(wěn)定性和操作性，分辨率高達 120,000 FWHM（200  m/z ），同時保持良好的靈敏度。去掉其全掃描和高掃描速度，使得無需考慮化合物數量上的限制，從而達到大量農藥同時篩查的目的，并滿足在復雜基質中檢測低濃度農藥殘留和提供（對樣品中其它成分）回顧性研究。不僅如此，Orbitrap 可將化合物的精確質量數與保留時間、同位素強度、同位素分布等信息結合，從而實現農藥的快速、準確篩查。

本研究基于 Thermo Fisher Scientific 最新氣質高分辨產品，建立了 435 種農藥化合物精確質量數據庫，可在 35 分鐘內完成樣品數據采集以及農藥未知物篩查的工作，具有靈敏度高、分辨率好，特異性強、重現性好等特點。在常見水果蔬菜農藥多殘留檢測中獲得良好的效果。

2.實驗部分
2.1 儀器和方法
2.1.1 氣相條件
  儀器型號：Thermo Scientific TM TRACE 1310 GC
  進樣體積：1.0 µL
  襯管：PTV 不分流進樣
  不分流時間：1 min
  載氣：氦氣，1.2 mL/min
  柱溫箱溫度程序：初始溫度 40 ℃，保持 1.5 min；以 25 ℃/min升至 90 ℃，保持 1.5 min；以 25 ℃/min 升至 180 ℃，保持0 min；5 ℃/min 升至280℃，保持 0 min；10 ℃/min升至300 ℃，保持3 min。

2.1.2 質譜條件
  儀器型號：Thermo Scientific TM Q Exactive-GC 質譜儀
  傳輸線：250 ℃
  離子化類型：EI
  離子源：280 ℃
  電子能量：70 eV
  采集模式：高分辨全掃描（FullScan）
  質量分辨率：60,000 FWHM（200  m/z ）
  掃描范圍：50-700 m/z

2.2 樣品前處理方法：
1. 水果蔬菜樣品
基于《GBT 23206-2008果蔬汁、果酒中 512 種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》，以正己烷為定容液 [5] 。

3.實驗與結果
3.1 高分辨質譜的定性能力
按照歐盟方法學標準，質譜方法必須達到4個定性點的確證要求[6] ，對于三重四極桿串接，通常只檢測2對母離子和子離子，因此其定性點往往只有4-5個；而對于高分辨質譜，由于其對精確質量數進行全掃描測定，因此其每個離子被定義為2個定性點，相對豐度在基峰 10% 以上的離子可以作為定性離子使用。因此，按照以上規(guī)則，Q Exactive-GC 所采集數據的定性點均在4個以上，并可以實現全掃描圖譜的庫檢索工作。在化合物的準確定性上具有強大優(yōu)勢。

3.2 儀器性能

3.2.1 掃描速度
通常情況下農藥的峰寬在 3-10 s（與色譜峰的位置及濃度有關）之間，每一個色譜峰至少要滿足 8-10 掃描點數以保證數據采集的準確性。
Q Exactive-GC 在 60, 000 分辨率下，仍能達到 7.0 spectrum/s以上的采集速率，使數據獲得足夠多的掃描點數。同時更重要的是每個掃描點數上質量準確度可以保持在 1.0 ppm 以內，保證了數據的穩(wěn)定性和可靠性。如圖 1 所示。

3.2.2 質量準確度和穩(wěn)定性
超高分辨率使儀器精確質量數測定上的優(yōu)勢得到了完美發(fā)揮，有利于對未知化合物進行定性定量測定。但精確質量數
的測定會受到基質干擾、化合物濃度、儀器狀態(tài)、外部環(huán)境等因素的影響，保證較低的精確質量數偏差，才能使定性的確證度更高。實驗中測定了1345個碎片離子，其實測值與理論值的質量偏差均在 1 ppm 范圍內，如圖 2 所示。結果表明，Q Exactive-GC 在大量的數據采集過程中能保持良好的質量偏差，結果可靠性更高。
實驗同樣對于化合物每個采集點的質量精度進行了探究，化合物毒死蜱（Chlorpyrifos）每個采集點中，碎片離子
（196.91964）的質量偏差均能保持在 0.5 ppm 內，如圖3所示。Q Exactive-GC 在每個掃描過程中，均可保持良好的質量精度。

3.2.3 超高分辨性能
在有基質干擾時，分辨率的高低會影響到精確質量的測定。超高分辨率會提高儀器精確質量數測定的準確性，可以對精確質量極為接近的化合物進行有效鑒別。實驗中，分別在四種不同分辨率（15,000；30,000；60,000；120,000）下對化合物 10 µg/L 氯苯胺靈（Chlorpropham）碎片離子（m/127.01833）在大蔥樣品的測定結果，當分辨率低于 60,000時，離子與同重元素的干擾離子無法分開。因而在判斷上會發(fā)生假陰性或假陽性結果。只有當分辨率在60,000 及以上時，兩個同重元素離子可以明顯區(qū)分，并可以對氯苯胺靈快速判斷和準確定量，如圖4所示。

3.2.4 超強的抗干擾能力
實驗同樣考察了對于相對復雜的基質，Q Exactive-GC 基于高分辨率及高質量精度，可通過精確質量數達到完美的色譜分離。如圖5所示，煙草基質中，低濃度下（10.0 µg/L）仍能得到高質量的色譜峰。

3.3 篩查數據庫（Database）的建立
本實驗選取了435種農藥化合物，配制成2.0 mg/L的混合標準溶液，由儀器測定，在全掃描模式（FullScan）下獲得相應化合物的保留時間，碎片離子的精確分子量、化學式等信息。每種化合物選取 2-5 個碎片離子，獲得離子信息（精確質量、化學式）。數據導入TraceFinder中，建立相關數據庫（Database）。如圖 6 所示。TraceFinder不僅可以實現數據快速、批量、自動化處理，而且集成定性、定量及方法建立等功能，根據建立的Database可實現目標物篩查（Targeted Screening），對檢測樣品中的農藥殘留進行快速篩查。Database 中主要包含化合物名稱、CAS 登記號、碎片離子信息（精確質量、化學式），保留時間等信息。

3.4 篩查參數的優(yōu)化
保留時間是化合物在色譜條件下的特征參數。對于本實驗而言，定性主要依賴于精確質量數，但同時保留時間的限定可有效降低假陽性結果的檢出，提高篩查的準確性以及速度。Trace1310  氣相色譜具有高度的穩(wěn)定性，保證了化合物保留時間的穩(wěn)定性。多次測定，同一化合物的保留時間偏差均在±0.1 min 范圍內，考慮到基質干擾對保留時間造成的偏移，實驗將保留時間偏差設定在 ±0.2 min 范圍內。化合物具備的同位素簇信息對于定性具有重要意義，對于本次研究的農藥化合物其元素組成主要以 C, H, O, N, P, S, F, Cl,Br, I 為主，其中 C, S, Cl, Br同位素的貢獻均超過了1.0%，特別是Cl和Br的同位素貢獻占到了32.0%和97.3%，并且隨著化合物中元素個數的增加，同位素貢獻呈現上升的趨勢。
本實驗中，化合物的同位素分布與同位素豐度信息在檢索得分中具有重要貢獻，其作為篩查的一項重要參數和判斷依據。TraceFinder可根據離子的化學式自動生成相應的同位素峰理論信息，自動與測定值相比較。以農藥除草醚（Nitrofen）為例，其基峰離子化學式為  C 12 Cl 2 H 7 NO 3 ，實際測得同位素峰簇的每個精確質量數和其豐度比都與理論值相匹配。如圖 7 所示。

3.5 篩查結果
本實驗配置了溶劑標準與基質標準對農藥化合物數據庫進行了驗證，選取了 2 種常見的水果蔬菜樣品（蘋果及黃瓜）。結果顯示，10.0 µg/kg 濃度下，435 種化合物均能檢測到。
實際樣品中，10.0 µg/kg 濃度下，所有化合物峰形良好，碎片離子均能檢出且離子比率高度匹配。如圖 8 所示。

所有農藥能夠在一律標準（10.0 µg/kg）下定性檢出，方法的靈敏度完全能夠滿足農殘日常檢測的需要。實驗同時考察了10.0 µg/kg 以下，農藥檢出情況。對于部分農藥，即使在0.1 µg/kg極低濃度下，仍能得到滿意的檢測效果。如圖 9 所示。

本實驗主要是基于農藥化合物精確質量信息，來進行農藥殘留篩查。因此，需要對 Database 為基本的篩查限進行研
究。以蘋果、黃瓜空白樣品制備濃度為 0.1, 0.5, 1.0, 10.0,20.0, 50.0 µg/kg（435 種農藥）的基質標準，進行測定。采用篩查數據庫對測定結果進行 Targeted Screening，對于蘋果、黃瓜 2 種基質中農藥檢出情況進行統(tǒng)計。結果發(fā)現，在1.0 µg/kg 及以下濃度，檢出農藥占比分別為 92.4%、93.6%（見圖 10）。由此可知，100% 以上的農藥能夠在一律標準（10.0 µg/kg）下定性檢出，方法的靈敏度完全能夠滿足農殘日常檢測的需要，絕大部分農藥在較低濃度下仍能檢出。

4.結論
本實驗利用 Q Exactive-GC 超高分辨率、穩(wěn)定的質量精度以及高靈敏度與 TraceFinder 軟件結合，建立了 435 種農藥化合物精確質量數據庫，利用化合物的精確質量數與保留時間，同位素強度，同位素分布等信息結合，對不同基質的農產品樣品進行快速篩查。實驗中儀器分辨率選擇了最少 60,000FWHM（200  m/z ）來提高檢測結果的可靠性，同時可以減少過多假陽性帶來判斷上的繁瑣，因此加快了篩查的速度和方便性。而在此分辨率下，篩查靈敏度可達到 10.0 µg/kg 或更低，完全能夠滿足農殘日常檢測的需要。

參考文獻
[1]. http://www.chinapesticide.gov.cn/
[2]. http: / /www.mrldatabase.com/results.cfm
[3]. GB2763-2014《食品中農藥最大殘留限量》
[4]. Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors(high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): "Where is the crossover point?"A. Kaufmann et al. / Analytica Chimica Acta 673 (2010) 60–72
[5]. GBT 23206-2008《果蔬汁、果酒中 512 種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》
[6]. 《EC 657-2002》