威斯騰生物經(jīng)過(guò)10多年的發(fā)展，獲得了上百種細(xì)胞株和四十余鐘原代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，并建立了龐大的細(xì)胞庫(kù)及原代培養(yǎng)資料庫(kù)；細(xì)胞平臺(tái)有資深實(shí)驗(yàn)員、規(guī)范的SOP操作文件，萬(wàn)級(jí)凈化細(xì)胞房，這些條件為保質(zhì)保量完成每個(gè)客戶(hù)的實(shí)驗(yàn)提供了保障。

 

同時(shí)，威斯騰生物結(jié)合多年原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合平臺(tái)已有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了完善的體外藥篩實(shí)驗(yàn)，并引進(jìn)RTCA（Real-time cellular Analysis，實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞記錄儀），在藥篩過(guò)程中，全程實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞真實(shí)狀況，為藥篩提供最真實(shí)精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

 

威斯騰生物與上海中科院生物與細(xì)胞所化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)合作，享有英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究院科技轉(zhuǎn)化部MRCT獨(dú)家提供的約1萬(wàn)種核心結(jié)構(gòu)小分子化合物庫(kù)資源，基于成藥性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，特別適于進(jìn)行以新藥研發(fā)為目的的活性化合物篩選。精選SiRNA庫(kù)，包含20個(gè)亞庫(kù)，可根據(jù)需求定制提高通路篩選。

 

 

 

淋巴細(xì)胞主要來(lái)源：脾臟、外周血

 

分離方法：Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度離心法，因?yàn)檠�液中各成分的比重存在差異，因此得以分離。

 

分離效果：?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過(guò)25℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率。

 

1）眼球取血，將血液滴入肝素抗凝管中，加入PBS按1：1稀釋血液（一般采血管2mL+2mL）。

2）取淋巴細(xì)胞分離液2mL于15mL滅菌離心管中待用。

3）吸取稀釋血液，在離分層液上方1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液上，并與分離液形成明顯界面。

4）室溫，離心2000rpm，20min。此時(shí)離心管中形成5層：最上面是血漿，血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間是淋巴細(xì)胞層呈白膜狀。

5）小心吸取中間呈白膜狀的淋巴細(xì)胞層，盡量全部吸出。加5倍以上體積的PBS洗2次，每次離心1500rpm，10min。

6）去上清液，加入1640培養(yǎng)基1mL混勻，取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7）用臺(tái)盼藍(lán)染液檢查所分離的細(xì)胞活性：活性應(yīng)在95％以上。

8）接種后培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。3d后，每48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)基。

 

 

淋巴細(xì)胞

 

 

乳鼠心肌細(xì)胞屬于原代生長(zhǎng)細(xì)胞。心肌組織中心肌細(xì)胞約占50%，非心肌細(xì)胞占50%，用酶消化法將心肌組織碎塊經(jīng)純化分離成單個(gè)心肌細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成心肌細(xì)胞懸液，內(nèi)心肌細(xì)胞可達(dá)95%，在體外適宜條件下，使心肌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。在乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能直接觀察到培養(yǎng)心肌細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，還可利用電鏡手段、同位素標(biāo)記、放免法和免疫組化法來(lái)研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。

 

1）新生乳鼠剪開(kāi)胸，取心尖部位。

2）剔除周?chē)�結(jié)締組織，將心臟置于無(wú)菌平皿中，將心臟盡量剪碎，平皿內(nèi)加入適量0.125%的胰酶，在37℃培養(yǎng)箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。
3）每次消化后取上清液，中和胰酶的消化，防止消化過(guò)度。用200目過(guò)濾篩過(guò)濾混合液。離心后收集沉淀，用PBS再次重復(fù)離心3次。用細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

4）培養(yǎng)90min左右，將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出。此時(shí)已經(jīng)貼壁的是心肌成纖維細(xì)胞。

5）將未貼壁的細(xì)胞懸液放入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并每日觀察心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

 

 

心肌細(xì)胞48h

 

 

步驟：

1）出生 2 d SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開(kāi)皮膚、肌肉、皮下筋膜，無(wú)菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks平衡鹽液中。

2）在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。

3）用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液（DMEM＋10％FBS）的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。

4）用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM＋10％FBS的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。

5）將所收集的上清經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾。

6）過(guò)濾后的細(xì)胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細(xì)胞懸液。

7）細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內(nèi)，放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后換液并加入Ara-C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。

 

 

皮層神經(jīng)元

 

 

試驗(yàn)方法：組織貼塊法

 

1)頸椎脫臼處死小鼠，開(kāi)胸、腹腔，暴露心臟剪取胸主動(dòng)脈
2)用鑷子輕輕剝離血管外結(jié)締組織
3)用眼科剪沿縱軸剪開(kāi)血管條，無(wú)菌鑷輕輕刮除內(nèi)膜
4)用鑷子鈍性加壓刮中膜,待出現(xiàn)裂口后夾住中膜將其取出
5)將取下的中膜加入含 20%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液，用眼科剪剪碎成血管條；
6)用無(wú)菌滴管將組織塊吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，均勻鋪于瓶壁，間距約 0.2～0.5cm；
7)將培養(yǎng)瓶直立放置于培養(yǎng)箱；1h 后輕輕放平
8) 每 3d 換液 1 次； 3～8代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)

 

 

血管平滑肌細(xì)胞

 

 

中心可提供原代培養(yǎng)種類(lèi)（部分）
呼吸系統(tǒng)	肺微血管上皮細(xì)胞 肺成纖維細(xì)胞 氣管上皮細(xì)胞
循環(huán)系統(tǒng)	心肌細(xì)胞 心肌成纖維細(xì)胞 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
消化系統(tǒng)	腸平滑肌細(xì)胞 食管上皮細(xì)胞 胃上皮細(xì)胞
泌尿系統(tǒng)	腎系膜細(xì)胞 腎小管上皮細(xì)胞 膀胱逼尿肌細(xì)胞
腦、神經(jīng)系統(tǒng)	大腦皮質(zhì)神經(jīng)元 大腦海馬神經(jīng)元 膠質(zhì)細(xì)胞 微血管內(nèi)皮細(xì)胞
骨、關(guān)節(jié)、肌肉系統(tǒng)	骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨細(xì)胞 破骨細(xì)胞 軟骨細(xì)胞
生殖系統(tǒng)	子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞
眼耳鼻喉口腔系統(tǒng)	牙源性間充質(zhì)細(xì)胞 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞
血液、淋巴系統(tǒng)	外周血淋巴細(xì)胞 DC細(xì)胞 NK細(xì)胞等

 

 

威斯騰生物與上海中科院生物與細(xì)胞所化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)合作，享有英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究院科技轉(zhuǎn)化部MRCT獨(dú)家提供的約1萬(wàn)種核心結(jié)構(gòu)小分子化合物庫(kù)資源，基于成藥性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，特別適于進(jìn)行以新藥研發(fā)為目的的活性化合物篩選。精選SiRNA庫(kù)，包含20個(gè)亞庫(kù)，可根據(jù)需求定制提高通路篩選。

 

高內(nèi)涵篩選：通過(guò)高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息，確定其生物活性和潛在毒性。

 

高通量篩選：以為扮形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，通一時(shí)間檢測(cè)數(shù)以千萬(wàn)的樣品，并有相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持運(yùn)轉(zhuǎn)，微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確。

 

高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀Opera

 

高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀Operetta

 

 

高通量自動(dòng)化藥物篩選實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

 

 

高通量自動(dòng)化siRNA文庫(kù)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

 

中心可制備的原代培養(yǎng)細(xì)胞（部分）

 

原代細(xì)胞名稱(chēng)	來(lái)源	分離時(shí)間	鑒定指標(biāo)	鑒定方法
大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞	大鼠	3-4h	膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)	IHC/IF
大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞	大鼠	3-4h	神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)	IHC/IF
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞	大鼠/小鼠/兔	3-4h	CD44+CD34-	流式表面抗原檢測(cè)
小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞	小鼠	3-4h	Iba1	IHC/IF
大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞	大鼠	3-4h	Ⅷ因子相關(guān)抗原	IHC/IF
大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞	大鼠	3-4h	α-SM-Actin	IHC/IF
大鼠心肌細(xì)胞	大鼠	4-5h	α-actin	IHC/IF
大鼠心肌成纖維細(xì)胞	大鼠	3-4h	a-SA抗體	IHC/IF
小鼠血管平滑肌細(xì)胞	小鼠	3-4h	肌動(dòng)蛋白α-SMA	IHC/IF
大鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞	大鼠	3-4h	波形絲蛋白（vimentin） 角蛋白（keratin）	IHC/IF
小鼠脾臟淋巴細(xì)胞	小鼠
小鼠巨噬細(xì)胞	小鼠
小鼠附睪精子細(xì)胞	小鼠
老年鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞	老年鼠	3-4h	D44+CD45-	流式表面抗原檢測(cè)
瘢痕組織成纖維細(xì)胞	瘢痕組織	3-4h	波形蛋白	IHC/IF
大鼠皮層神經(jīng)元干細(xì)胞﹡	大鼠	3-4h	Nestin	IHC/IF
骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）﹡﹡	骨髓	3-4h	CD34與CD133	IHC/IF
﹡：神經(jīng)元干細(xì)胞原代培養(yǎng)通常需要額外的細(xì)胞因子如B-27、EGF、bFGF
﹡﹡：EPCs原代培養(yǎng)需要特殊培養(yǎng)基

 

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