應(yīng)用Target MS2 方法對(duì)大鼠血漿中人重組干擾素進(jìn)行絕對(duì)定量的測(cè)試方案

 

顧培明

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛深入到生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)由傳統(tǒng)的大規(guī)模鑒定逐步轉(zhuǎn)向了靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，研究?jī)?nèi)容已經(jīng)由蛋白質(zhì)鑒定擴(kuò)展到了蛋白質(zhì)相對(duì)和絕對(duì)定量，對(duì)復(fù)雜樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)與絕對(duì)定量有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物，對(duì)于研究各類(lèi)疾病的發(fā)生與發(fā)展有著重要的意義。

 

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法主要有SILAC，TMT，iTRAQ 以及應(yīng)用三重四級(jí)桿的MRM 等，本文主要介紹了賽默飛世爾新一代臺(tái)式高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive 在目標(biāo)蛋白質(zhì)定量方面的應(yīng)用。結(jié)果顯示Q-Exactive不僅可以在ng級(jí)上樣量情況下達(dá)到98% 以上的蛋白質(zhì)氨基酸序列匹配度，同時(shí)應(yīng)用target ms2 方法，可以很好的對(duì)復(fù)雜樣本中目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量，其定量下限達(dá)到了amol，動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到了6 個(gè)數(shù)量級(jí)，且線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在0.99 以上。

 

 

 

人重組干擾素α-2b 標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為1mg/ml），注射人重組干擾素α-2b 后的處理組大鼠血漿樣本以及空白大鼠血漿樣本。

 

1. 使用Full MS/ddMS2 方法對(duì)人重組干擾素α-2b 標(biāo)準(zhǔn)品酶解的肽段進(jìn)行鑒定，篩選其unique peptide；

2. 將人重組干擾素α-2b 標(biāo)準(zhǔn)品酶解肽段稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度分別為104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，并摻入至空白大鼠血漿樣本酶解肽段中，分別上樣18ul，使用Target MS2 方法根據(jù)其unique peptide 的fragment ion 峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

3. 處理組大鼠血漿酶解肽段上樣18ul， 根據(jù)其unique peptide 的fragment ion 峰面積計(jì)算出大鼠血漿中人重組干擾素α-2b 的濃度。

 

高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000

色譜柱：C18 ,3μm, 100Å ,75μm×15 cm

上樣量：均18 ul

流動(dòng)相：A：0.1% Formic acid in water； B：0.1% Formic acid

in Acetonitrile

 

色譜梯度：

 

標(biāo)準(zhǔn)品：

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive

噴霧電壓：2.6 kV

毛細(xì)管溫度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率設(shè)置：一級(jí)70,000@m/z 200，二級(jí)17,500@m/z 200

母離子掃描范圍：m/z 200-1800；子離子掃描范圍：startfrom m/z 100

Data-dependent MS/MS：Top 20

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與正式樣本：

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive

噴霧電壓：2.6 kV

毛細(xì)管溫度：250 ℃

S-lens：50%

碰撞能量：27% HCD

分辨率設(shè)置：35,000@m/z 200

Isolation Window：4 M/Z

Inclusion List：M/Z 451.75

 

首先使用Q-Exactive 對(duì)人重組干擾素α-2b 標(biāo)準(zhǔn)品的酶解肽段進(jìn)行Full MS/ddMS2 掃描，上樣量為500ng（不計(jì)酶解損失），篩選人重組干擾素α-2b 的unique peptide，該肽段必須為人重組干擾素α-2b 所特有的肽段，才可以用于表征人重組干擾素α-2b 的量。

 

下圖展示的為人重組干擾素α-2b 色譜質(zhì)譜的原始圖，圖中可見(jiàn)，整個(gè)色譜峰分離比較均一，強(qiáng)度比較高。

 

 

將上述得到的原始文件使用Byonic 軟件進(jìn)行搜庫(kù)處理，觀(guān)察蛋白質(zhì)的序列匹配度，數(shù)據(jù)庫(kù)使用DrugBank 下載的人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列。

 

 

從上述表格可見(jiàn)，人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列匹配度達(dá)到了98.18%，說(shuō)明Q-Exactive 的超高靈敏度，在不到500ng 的上樣量的情況下可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高氨基酸序列匹配度的分析，對(duì)于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性非常重要。

下圖展示的是人重組干擾素α-2b 的具體氨基酸序列匹配情況。圖中綠色標(biāo)記的氨基酸序列為鑒定到的氨基酸，紅色標(biāo)記的為鑒定到的帶有修飾的氨基酸，黑色標(biāo)記的為實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有鑒定到的氨基酸。

 

 

從上述圖中可以看出，165 個(gè)氨基酸中只有最后三個(gè)氨基酸沒(méi)有被鑒定到，分析發(fā)現(xiàn)162 位的氨基酸為R，因而在Trypsin 的酶解中會(huì)被切割，產(chǎn)生的肽段為最后三個(gè)氨基酸，該肽段過(guò)短，不適于質(zhì)譜檢測(cè)。

 

從上述的色譜質(zhì)譜原始圖中可以看出在洗脫時(shí)間為36.28min，m/z 為451.75 的色譜峰其強(qiáng)度最高， 搜庫(kù)

結(jié)果顯示該色譜峰為人重組干擾素α-2b 的unique peptide“EDSILAVR”，下圖展示的是EDSILAVR（m/z 451.75）的母離子色譜質(zhì)譜抽提峰及其二級(jí)譜圖，

 

 

下圖為上述的肽段EDSILAVR 二級(jí)譜圖的解析情況，圖中可見(jiàn)所有的y 系列離子均被鑒定到，子離子的實(shí)測(cè)m/z 與理論m/z 偏差均在10-3 水平，譜圖質(zhì)量非常高，結(jié)果非�？尚拧Ａ硗�，從二級(jí)譜圖中可以看出，二級(jí)碎片子離子y4 ，m/z 458.31，其強(qiáng)度最高，因而在隨后的數(shù)據(jù)分析中選取451.75- 458.31 這一母離子- 子離子對(duì)來(lái)表征EDSILAVR的含量，進(jìn)而表征人重組干擾素α-2b 的含量（該方法即為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)：SRM Selected Reaction Monitoring）。

 

 

人重組干擾素α-2b 酶解的標(biāo)準(zhǔn)肽段稀釋成以下幾個(gè)濃度：104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，各自吸樣8ul， 與10ul 空白血漿酶解的肽段樣本混勻，上樣18ul，質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)方法使用TargetMS2，inclusion list 為m/z 451.75，isolation window 為4 m/z。對(duì)子離子458.31 進(jìn)行抽提，結(jié)果見(jiàn)下圖。

 

 

從上圖可以看出，所有6 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品均在36min 左右有一個(gè)色譜洗脫峰出現(xiàn)，與上述標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間一致，該色譜峰為451.75-458.31 母離子- 子離子對(duì)的色譜峰，即EDSILAVR 的洗脫峰，分別對(duì)各個(gè)色譜峰的峰面積（即上圖中色譜峰上顯示的MA 數(shù)值）進(jìn)行積分，結(jié)果見(jiàn)下述表格。

 

 

 

 

從上述結(jié)果中可以看出，在6 個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在0.99 以上，說(shuō)明Q-Exactive的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍足夠大，可以很好的應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

 

 

大鼠血漿樣本上樣18ul，質(zhì)譜檢測(cè)，原始結(jié)果見(jiàn)下圖，圖中可見(jiàn)在35.33min 有一個(gè)明顯的色譜洗脫峰出現(xiàn)，洗脫時(shí)間與上述的標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間相一致，為血漿樣本中的人重組干擾素α-2b 的肽段EDSILAVR 的洗脫峰，對(duì)m/z 458.31 這一子離子的面積進(jìn)行積分。

 

 

峰面積為9787, 代入上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中進(jìn)行計(jì)算，得出原始血漿中人重組干擾素α-2b 濃度為26.9185 ng/ml。

 

綜上所述，Q-Exactive 擁有超高的靈敏度，在不到500ng 上樣量的情況下對(duì)人重組干擾素α-2b 的氨基酸序列匹配度達(dá)到了98.2%；Q-Exactive 擁有足夠高的動(dòng)態(tài)范圍，在對(duì)人重組干擾素α-2b 的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)中，其動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到了6個(gè)數(shù)量級(jí)，并且線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.99 以上。簡(jiǎn)而言之，Q-Exactive 的超高性能可以很好的應(yīng)用于大分子藥物代謝的研究中去。