本文將大致回顧小鼠轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的顯微操作技術(shù)，包括CRISPR/Cas9技術(shù)，旨在對(duì)這類(lèi)客戶(hù)所用的工作流程和術(shù)語(yǔ)進(jìn)行介紹。此外，還針對(duì)有用的顯微操作系統(tǒng)配置提供一些建議。

顯微操作技術(shù)概述

圖1：CRISPR/Cas9、原核注射和胚胎干細(xì)胞移植技術(shù)的粗略比較。更多詳情請(qǐng)參閱下文。

小鼠胚胎早期發(fā)育階段

 

圖2：小鼠胚胎早期發(fā)育階段示意圖（夜間受精，早上注射。）（來(lái)源：http://dev.biologists.org/content/137/6/859）

圖3：原核階段示意圖（透明帶標(biāo)為紅色）

 

圖4：囊胚結(jié)構(gòu)示意圖

顯微操作技術(shù)

原核注射（PNI）和胚胎干細(xì)胞移植（ESI）

不管是否涉及CRISPR（或者TALEN、ZFN（見(jiàn)第4章）），都要使用原核注射/受精卵注射技術(shù)或胚胎干細(xì)胞注射技術(shù)。這兩種技術(shù)是成熟的主流技術(shù)，在世界范圍內(nèi)使用：

原核注射

受精后約12小時(shí)，出現(xiàn)了一個(gè)卵子原核和一個(gè)精子原核（圖2）。在原核融合為一體并構(gòu)成受精卵細(xì)胞核之前，將DNA注入原核階段受精卵內(nèi)的一個(gè)原核中，直徑約80-100µm。注射的靶DNA隨機(jī)整合到基因組DNA。方向和拷貝數(shù)不可預(yù)測(cè)，即這是一種非靶向技術(shù)，快速直接地獲得感興趣的轉(zhuǎn)基因小鼠概率非常有限。

圖5：PNI。以固定毛細(xì)管固定PN階段的小鼠胚胎（左側(cè)）。經(jīng)由毛細(xì)管將溶于緩沖液的少量DNA注入其中一個(gè)原核（右側(cè)）�？煽匆�(jiàn)被注射的原核發(fā)生膨脹。圖片以徠卡DIC采集 。

 

圖6：PN 注射過(guò)程DNA 隨機(jī)非靶向整合到基因組中

典型的PNI系統(tǒng)設(shè)置：

-DMi8：手動(dòng)、電動(dòng)部件可供選擇

-透射光軸； S28聚光鏡及微分干涉差

-5/10倍物鏡（FLUOTAR或N PLAN）用于大致觀察

-20倍、40倍長(zhǎng)工作距離物鏡。40倍物鏡用于注射

-3板載物臺(tái)（固定載物臺(tái)的物體導(dǎo)桿妨礙顯微操作器�。�

-精選顯微操作器（優(yōu)選直接注入的毛細(xì)管：平角有助于盡可能降低胚胎受損程度）

-氣壓式手動(dòng)顯微注射儀用于固定（逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的負(fù)壓可固定胚胎）

- FemtoJet®顯微注射儀（少量液體，壓力x 時(shí)間 = 體積）

-根據(jù)實(shí)驗(yàn)室偏好選擇樣品載體（玻璃底器皿、蓋玻片等）

PN注射通常在室溫下借助放大400倍的微分干涉差顯微鏡（一些還使用IMC）完成。（一些情況下還將胚胎冷卻至10°C，使質(zhì)膜更僵硬以方便注射）

胚胎干細(xì)胞移植

胚胎干細(xì)胞注入囊胚（圖4），囊胚階段從第3.5天開(kāi)始，約128個(gè)細(xì)胞。內(nèi)細(xì)胞群由多能性胚胎干細(xì)胞組成，也就是說(shuō)它們可以發(fā)育并分化為不同類(lèi)型細(xì)胞。有時(shí)注入八細(xì)胞階段的桑椹胚胎 （圖9）。

圖7：ESI。以固定的毛細(xì)管（左側(cè)）固定小鼠胚囊。經(jīng)由毛細(xì)管將基因修飾的胚胎干細(xì)胞注入囊胚腔（右側(cè)）。注射在內(nèi)細(xì)胞群外滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞之間完成。圖片以徠卡AM6000上的徠卡DIC采集。

注入的胚胎干細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞發(fā)育為小鼠。這是一只嵌合體小鼠，其細(xì)胞/器官來(lái)源于注入的胚胎干細(xì)胞（雄性）和胚囊（雄性/雌性）。

目的基因的編輯在胚胎干細(xì)胞移植注射前完成，這耗時(shí)大約3-4個(gè)月 ，直至攜帶基因組DNA靶序列的ES細(xì)胞克隆被選定。大部分時(shí)間里修飾只出現(xiàn)在一個(gè)等位基因，意味著嵌合體是雜合的。產(chǎn)生的克隆在1個(gè)等位基因上攜帶靶突變（在兩個(gè)等位基因上的概率非常低）。這項(xiàng)技術(shù)允許插入大約10-20 kB的DNA。靶向突變所用方法為同源重組。

 

圖8：ES細(xì)胞DNA的靶向整合/突變

1）利用分子生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)建含有靶DNA以及新霉素抗性位點(diǎn)、翻轉(zhuǎn)酶識(shí)別位點(diǎn)（FTR）和CRE重組酶識(shí)別位點(diǎn)（loxP）的DNA。

2）通過(guò)轉(zhuǎn)染方式將靶DNA注入ES細(xì)胞。重組體通過(guò)同源重組整合到基因組DNA。

3）往細(xì)胞培養(yǎng)物中添加新霉素（一種抗生素），以選擇產(chǎn)生的ES克隆。只有具備新霉素抗性的克隆才能存活生長(zhǎng)。挑出這些克隆繼續(xù)培養(yǎng)。

4）添加翻轉(zhuǎn)酶（一種切割DNA并將其重新結(jié)合的重組酶），消除新霉素抗性。

5）通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠與另外一只轉(zhuǎn)基因“CRE小鼠”交配，loxP位點(diǎn)可以條件性敲除。表達(dá)CRE重組酶的小鼠通常具有類(lèi)似組織特異性的表達(dá)，這種特異性的表達(dá)使小鼠具備例如在大腦中的基因的靶向敲除。

經(jīng)由同源重組及ES細(xì)胞注射的靶向突變，多年來(lái)已成為“金標(biāo)準(zhǔn)”。與CRISPR相比，不足之處包括：

• 載體準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)

• 選擇ES細(xì)胞克隆費(fèi)時(shí)

• 載體克隆和ES細(xì)胞工作耗時(shí)約3個(gè)月

• 生成純合子小鼠耗時(shí)約1年

如上所述，在大約 99% 的案例中，產(chǎn)生的嵌合體是雜合的。最終目的是獲得用于研究的純合子動(dòng)物。

這是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的交配、篩選過(guò)程：

1)    胚囊（♀或♂）+ ES細(xì)胞（♂）產(chǎn)生♂嵌合體。目的是獲得生殖細(xì)胞中具有ES細(xì)胞修飾的嵌合體

2)    ♂ 雜合嵌合體 + WT ♀產(chǎn)生雜合F1（♂或♀）

3)    雜合♂ + 雜合♀ 產(chǎn)生純合F2代

純合子小鼠的兩個(gè)等位基因上均攜帶突變。最終獲得這些有價(jià)值的動(dòng)物耗時(shí)1年左右！

典型的ES移植系統(tǒng)設(shè)置：

-DMi8：手動(dòng)、電動(dòng)部件可供選擇；

-透射光軸；S28聚光鏡

-DIC為非必需。胚胎在胚囊階段已經(jīng)足夠大，其細(xì)節(jié)容易觀察。

- 5/10倍；20倍；40倍長(zhǎng)工作距離物鏡；較小NA = 較大景深

-3板載物臺(tái)（固定載物臺(tái)的物體導(dǎo)桿妨礙顯微操作器！）

-精選顯微操作器（優(yōu)選直接注入的毛細(xì)管：平角有助于盡可能降低胚胎受損程度）

-氣壓式手動(dòng)顯微注射儀用于固定

-油壓式或油壓式帶齒輪手動(dòng)顯微注射儀用于注射ES細(xì)胞。

ES細(xì)胞注射通常在室溫下借助放大200倍的DIC/ IMC/PH顯微鏡完成。

ESI的差異在于將 ES細(xì)胞注入8細(xì)胞階段的胚胎中（圖9）。這項(xiàng)操作通常使用鈍端毛細(xì)管完成，以免損傷細(xì)胞。激光器（Hamilton-Thorne，Octax或Piezo壓電式破膜系統(tǒng)）可幫助鈍端毛細(xì)管穿過(guò)透明帶和膜。

圖9：ESI注入8細(xì)胞階段的胚胎。鈍端毛細(xì)管

圖10：EMBL轉(zhuǎn)基因過(guò)程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r顯微操作器和PiezoXpert壓電破膜儀。以鈍端毛細(xì)管進(jìn)行胚囊注射。DIC

用于小鼠轉(zhuǎn)基因的CRISPR/Cas 9技術(shù)

用于小鼠轉(zhuǎn)基因的CRISPR/Cas9技術(shù)為靶向突變提供了工具（如ESI），但無(wú)需繁雜的ES處理工作�。ó�(dāng)然CRISPR也可以用于ES細(xì)胞突變）。

轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)是一種更為成熟的技術(shù)。TALE（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子）是結(jié)合DNA特定序列的蛋白質(zhì)。TALE與核酸酶融合即為T(mén)ALEN，這是一種具有高度特異性的DNA剪刀。TALEN使雙鏈斷裂。修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致靶基因缺失或敲除。

目前，CRISPR技術(shù)相對(duì)于TALEN技術(shù)而言并不昂貴。

另外一種基因組編輯技術(shù)是鋅指核酸酶技術(shù)，它通過(guò)在用戶(hù)指定位置上造成DNA雙鏈斷裂而發(fā)生作用。

CRIPR/Cas9技術(shù)所用的工具如下所示：

向?qū)�RNA：這種RNA與用戶(hù)修飾的靶DNA同源。向?qū)�RNA與DNA上的大約20個(gè)核苷酸結(jié)合。RNA鏈的其余部分用于結(jié)合Cas9核酸內(nèi)切酶。需要對(duì)20個(gè)結(jié)合的核苷酸進(jìn)行設(shè)計(jì)，以找到/發(fā)現(xiàn)靶序列。

Cas9核酸內(nèi)切酶：切割效率高，有時(shí)甚至切割兩個(gè)等位基因。

將向?qū)�RNA和Cas9蛋白（或Cas9的DNA或mRNA）注射到受精卵里，Cas 9切割DNA，修復(fù)機(jī)制開(kāi)始起作用。該方法在第一代小鼠體內(nèi)產(chǎn)生點(diǎn)突變的概率高。更先進(jìn)的技術(shù)是注射攜帶靶基因或突變的同源DNA以及向?qū)�RNA/Cas9混合體。經(jīng)由同源重組插入DNA相當(dāng)有效。

小鼠轉(zhuǎn)基因用CRISPR/Cas9的優(yōu)點(diǎn)/缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

+  Cas  9切割效率非常高，有時(shí)甚至切割兩個(gè)等位基因，即可獲得同源1代小鼠！

+ 無(wú)需繁瑣的ES細(xì)胞處理工作

+ CRISPR/Cas9技術(shù)不依賴(lài)于小鼠（而PNI和ESI則依賴(lài)），即它也可用于其他物種 （豬等）。

缺點(diǎn)：

-  迄今已公布的最長(zhǎng)插入片段為3kB

-  目前l(fā)ox P條件性敲除效率低

需要注射高濃度黏性分子（如RNA、蛋白質(zhì)），會(huì)堵塞毛細(xì)管。因此需要更粗的毛細(xì)管，而且要求平角注射！

 

Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修復(fù)機(jī)制造成了點(diǎn)突變。

 

*注射gDNA+Cas9+同源的DNA

 

圖11：CRISPR/Cas9技術(shù)

典型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)置

與PN注射設(shè)置相同，以下除外：

將濃度較高的黏性CRISPR成分（RNA、蛋白質(zhì)）注入受精卵時(shí)需要使用較粗的毛細(xì)管。這些毛細(xì)管結(jié)構(gòu)筆直，內(nèi)徑較大，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均制作。

因此極力建議沿著真正的平角方向注射（見(jiàn)圖10），以避免胚胎受損。

此外，使用Piezo壓電式破膜系統(tǒng)，可以更輕松地穿過(guò)透明帶，尤其是質(zhì)膜。

顯微操作器水平移動(dòng)，將目標(biāo)片段注入懸浮細(xì)胞內(nèi)

圖12：受精卵注射過(guò)程的注射角度。顯微操作器水平移動(dòng)，零度角注射可使胚胎受損程度較輕。注射角度大于10° 將導(dǎo)致受精卵出現(xiàn)較大的“洞”，使其存活率降低。

徠卡顯微操作器的移動(dòng)角度可調(diào)，也就是說(shuō)，即便角度較陡，注射角度本身也是零度角！

這是徠卡顯微操作器的一大優(yōu)點(diǎn)：黏性的向?qū)�RNA和cas9蛋白混合物所需的較粗毛細(xì)管（減少堵塞）可以沿著零度角方向注射！

其他實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室）

-立體顯微鏡是選擇和控制胚囊、ES細(xì)胞和毛細(xì)管必不可少的工具。（如TL5000、M80、Rottermann contrast）

圖13：M80及TL5000 Ergo。PN注射后的雙細(xì)胞階段。

• DIC專(zhuān)用玻璃底器皿，一些實(shí)驗(yàn)室使用大號(hào)蓋玻片

• 毛細(xì)管：若干公司提供即買(mǎi)即用產(chǎn)品。許多轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室自己制作毛細(xì)管。

直線注射CRISPR/Cas9需要使用內(nèi)徑足夠大的毛細(xì)管。轉(zhuǎn)基因?qū)＜易约褐谱鳌案呒?jí)”毛細(xì)管以達(dá)到最高效率。

需要工具：

• 拉針器（如Sutter、Narishige）

• 磨具（用于毛細(xì)管拉拔后加工）

• 顯微拉制儀（用于彎曲毛細(xì)管）

上述顯微操作器：

• 徠卡機(jī)械式顯微操作器：轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域贊譽(yù)頗高的顯微操作器類(lèi)型。角度可調(diào)，即使毛細(xì)管角度較陡，也可獲得零度注射角。穩(wěn)健可靠，負(fù)載能力強(qiáng)，持久耐用。用戶(hù)眾多。當(dāng)移動(dòng)徠卡顯微操作器的控制桿時(shí)，可以感覺(jué)到毛細(xì)管觸及胚胎。

• Eppendorf TransferMan4r：全自動(dòng)顯微操作器，具有許多附加功能。可以平角注射。氣壓式、油壓式、油壓式帶齒輪和Femtojet手動(dòng)顯微注射器經(jīng)常用于其他顯微操作器。性能最優(yōu)，價(jià)格最高。

• Narishige：新式Takanome顯微操作器無(wú)平角操作功能。配備MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油壓式顯微操作器當(dāng)然首屈一指。注射器：IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。

防震：在很大程度上取決于注射室位于地下室還是高層建筑的十層（不管需要與否）。采用被動(dòng)（鐵板、沉重石桌、網(wǎng)球等）和主動(dòng)設(shè)置。

徠卡DMi8轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)特點(diǎn)

•    高度模塊化的倒置研究顯微鏡 – 根據(jù)客戶(hù)需要提供手動(dòng)/電動(dòng)組件

•    載物臺(tái)高度低 – 工效學(xué)效果更佳，胚胎操作更安全

•    顯微鏡穩(wěn)定 – 振動(dòng)較少

•    完美的徠卡光學(xué)系統(tǒng)！

•    最佳DIC！– 原核可視

•    智能自動(dòng)化 – 單擊按鈕便可使用/停用光學(xué)部件

•    集成調(diào)制和相襯 –  標(biāo)準(zhǔn)物鏡沒(méi)有調(diào)制器/PH圈

•    微型徠卡顯微操作器操作臺(tái)（位置靠近顯微鏡，因此靠近光軸/試樣）

•    徠卡操作器總是零度角注射！

•    徠卡顯微操作器：可靠、精確、知名度高

與Eppendorf和Narishige顯微操作器兼容

參考文獻(xiàn)

1. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

2. Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013

3. -Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system

4. Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013