近年來(lái)，由食源性致病微生物引發(fā)的疫情不斷發(fā)生，食品安全已成為世界各國(guó)共同面臨和關(guān)注的問(wèn)題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一�？焖俣鴾�(zhǔn)確地檢測(cè)出被稱為“頭號(hào)殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)，因此建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于從源頭制止食源性致病菌污染，預(yù)防疫情的發(fā)生具有重要意義。傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法主要有微生物培養(yǎng)法、電阻電導(dǎo)測(cè)定法、細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)方法等。但傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)方法，不僅步驟復(fù)雜，而且耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度也不高，難以滿足當(dāng)前的任務(wù)需求。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)(up-converting phosphor technology，UPT)是基于上轉(zhuǎn)發(fā)光材料(up-converting phosphor，UCP)而發(fā)展起來(lái)的一種新型標(biāo)記技術(shù)，UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的納米級(jí)顆粒。由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，UCP可由紅外光激發(fā)而發(fā)射可見(jiàn)光——上轉(zhuǎn)發(fā)光(up-converting)。這種絕無(wú)僅有的性質(zhì)使UCP作為標(biāo)記物在生物分析中，以無(wú)本底干擾、無(wú)焠滅、適于多重分析和定量分析等具有顯著優(yōu)勢(shì)，從本質(zhì)上有別于傳統(tǒng)標(biāo)記物。因此一種叫做上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒免疫層析(UPT-LF)的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，因其具有對(duì)樣品種類的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設(shè)備的限制，操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來(lái)。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)原理

UCP包括3種主要成分：主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu),可以出現(xiàn)反Stokes現(xiàn)象,即這種材料可在紅外光區(qū)(波長(zhǎng)>780nm)被激發(fā),卻發(fā)射波長(zhǎng)遠(yuǎn)短于激發(fā)光的可見(jiàn)光(波長(zhǎng)為475～670nm),這一現(xiàn)象在自然界中并不存在,其基本原理是雙光子或多光子熒光,即能量上轉(zhuǎn)。選擇不同的吸收子、發(fā)射子和主基質(zhì)可使UCP具有不同的光學(xué)性質(zhì),成為其使用靈活的基礎(chǔ)。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與經(jīng)典的免疫層析技術(shù)相結(jié)合，采用新型標(biāo)記物——UCP上轉(zhuǎn)發(fā)光材料，通過(guò)掃描分析光電信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原或抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)試紙條是由UPT與免疫層析共同組成，主要由試紙條以下5個(gè)部分組成：樣品墊、結(jié)合墊又稱結(jié)合物稀釋墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。疊合順序如下圖所示，通過(guò)粘膠固定于粘性底襯上。

檢測(cè)時(shí)，首先將待檢樣品滴加到樣品墊上，樣品通過(guò)滲透與虹吸作用進(jìn)入結(jié)合墊，使其中固定的標(biāo)記物——生物活性分子結(jié)合物重新解離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開(kāi)結(jié)合墊流入分析膜，向吸水墊的方向流動(dòng)。此過(guò)程中標(biāo)記物——生物活性分子結(jié)合物、目標(biāo)被檢物與檢測(cè)帶、質(zhì)控帶之間將發(fā)生一定的特異性免疫反應(yīng)，并通過(guò)具有指示性的標(biāo)記物產(chǎn)生反應(yīng)信號(hào)。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)發(fā)展歷程

我國(guó)屬稀土資源大國(guó)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和北京熱景生物技術(shù)有限公司早在2000年就已經(jīng)完成了UCP顆粒的制備，并且取得了一定的突破; 2002年創(chuàng)造了以UCP為基礎(chǔ)的自主研制PCT；2003年，研制出了第一代UPT免疫分析儀；2005年研發(fā)了第三代（UPT-3A）便攜式系統(tǒng)，應(yīng)用于國(guó)家安全、部隊(duì)、疾控生物戰(zhàn)劑檢測(cè)，在生物應(yīng)急領(lǐng)域，研制完成的UPT檢測(cè)系統(tǒng)可快速檢測(cè)鼠疫菌、炭疽芽孢、布魯氏菌、抗鼠疫抗體、抗SARS-CoV抗體、霍亂O1菌、霍亂O139菌等多種病原體，已推廣至多個(gè)地方疾控系統(tǒng)——北京市衛(wèi)生局、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、防化研究院、鼠疫防治系統(tǒng)等職能單位；2008年，UPT系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化；2011年獲得國(guó)內(nèi)第一個(gè)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)生產(chǎn)文號(hào)，并獲得了完整的工藝流程與系統(tǒng)產(chǎn)品，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了面向臨床、生物反恐、食品安全快速檢測(cè)儀器及試劑，總共獲得12個(gè)產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)，該系列產(chǎn)品打破了國(guó)外技術(shù)的壟斷，項(xiàng)目產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床檢測(cè)、軍隊(duì)和地方生物反恐、食源性致病菌檢測(cè)等；2014年該項(xiàng)目獲得中華醫(yī)學(xué)會(huì)二等獎(jiǎng)、北京市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)；2016年9月獲得北京市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目-生物技術(shù)領(lǐng)域第一名。

據(jù)WHO估計(jì)，由于全球性食品貿(mào)易的快速增長(zhǎng)以及人口的流動(dòng)，飲食習(xí)慣的改變，新食源性致病菌不斷出現(xiàn)，全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)10億人，每年約有200萬(wàn)兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細(xì)菌性致病菌所致。食源性致病菌導(dǎo)致的疾病是食品安全的關(guān)鍵問(wèn)題，其中動(dòng)物源性食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。

UCP作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無(wú)背景吸收、無(wú)焠滅等特點(diǎn)，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。傳統(tǒng)的橫向流方法通常用有色顆粒標(biāo)記，像膠體金或著色，通過(guò)顏色識(shí)別結(jié)果，然而，定性以及較低的靈敏度限制了其檢測(cè)應(yīng)用，而UCP顆粒在最低檢測(cè)線下仍然可以檢測(cè)，用基于橫向流的上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)分析，可以在10⁹CFU/mL的微生物環(huán)境下檢測(cè)到10³CFU/mL的大腸桿菌O157:H7，濃度變異系數(shù)在0～10⁷organism/mL之間均<10%，對(duì)于較小的微生物，最低檢測(cè)線在5ng/mL以下。而且，此技術(shù)可以進(jìn)行多重檢測(cè)，可同時(shí)進(jìn)行多靶標(biāo)檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，使用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙盒可對(duì)包括乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1、O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、副溶血弧菌、傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌在內(nèi)的10種食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，不增菌檢測(cè)敏感性為10⁹～10⁵CFU/mL，增菌敏感性<10CFU/mL。均可滿足食物樣本增菌檢測(cè)和腹瀉樣本直接檢測(cè)的靈敏度需求。線性擬合系數(shù)R2介于0.9～0.98之間，均具有良好的定量能力。每種試紙與其它9種菌之間無(wú)明顯交叉反應(yīng)，特異性良好。

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在食品病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用前景

李斯特氏菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食品致病菌，已經(jīng)成為威脅食品安全的頭號(hào)殺手，快速而準(zhǔn)確檢測(cè)出被稱為“頭號(hào)殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)。上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)的UCP顆粒因其具有對(duì)樣品種類的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設(shè)備的限制，操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來(lái)，可以廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)基層單位對(duì)食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及診斷。隨著對(duì)UCP研究的不斷深入，上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、產(chǎn)業(yè)需求以及發(fā)展前景將不可限量。