AAV-TBG-Cre/GOI在小鼠肝臟特異性基因表達(dá)或敲除中的應(yīng)用與優(yōu)勢分析
AAV-TBG-Cre/GOI系統(tǒng)簡介：
l AAV-TBG-Cre系統(tǒng)是整合了肝臟特異性TBG啟動子和Cre重組酶的腺相關(guān)病毒載體。
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Ø TBG啟動子是一種基于人甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)啟動子和微球蛋白增強(qiáng)子的混合型啟動子，用于肝臟特異性轉(zhuǎn)外源基因表達(dá)。 Ø Cre重組酶是在P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)的一種重組酶，具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即LoxP位點。Cre重組酶作用于同一DNA鏈上兩個同方向的LoxP位點時，可以有效刪除兩個LoxP位點之間的堿基序列，達(dá)到重組靶DNA鏈的目的。 Ø AAV8-TBG-Cre腺相關(guān)病毒可高效快速感染小鼠肝臟，目前被認(rèn)為是最特異的肝實質(zhì)細(xì)胞示蹤工具。 |
l 此外，本公司還提供靶基因的病毒定制服務(wù)AAV8-TBG-GOI（Gene of Interest），實現(xiàn)外源基因在肝實質(zhì)細(xì)胞中快速特異表達(dá)。
AAV-TBG-Cre/GOI的顯著特點：
l 最短時間完成——僅需1-2周
l 最高效率保障——高達(dá)100%
l 最低成本實現(xiàn)——低于KI/KO
原理&數(shù)據(jù)：
ROSA26-loxP-Stop-loxP-YFP小鼠尾靜脈分別注射1×1011 對照病毒AAV8-TBG-Blank（Control）和1×1011 AAV8-TBG-Cre病毒，一周后肝臟切片免疫組化檢測YFP表達(dá)，結(jié)果顯示>90%肝細(xì)胞表達(dá)YFP。
AAV-TBG-Cre/GOI相關(guān)產(chǎn)品& 服務(wù)：
AAV-TBG-Cre/GOI應(yīng)用優(yōu)勢：
l 完勝基于白蛋白啟動子的肝細(xì)胞特異性表達(dá)調(diào)控
表1.Alb和TBG啟動子的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較
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Alb-Cre和Alb-CreERT |
TBG-Cre |
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組織/細(xì)胞特異性 |
Alb啟動子，在肝實質(zhì)細(xì)胞和前體細(xì)胞中均有轉(zhuǎn)錄活性。 |
TBG啟動子，僅在成熟的肝實質(zhì)細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性。 |
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Alb-Cre，由于發(fā)育中肝前體細(xì)胞中有短時轉(zhuǎn)錄活性，其中一部分細(xì)胞可分化為膽管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致部分膽管上皮細(xì)胞非特異性表現(xiàn)。 |
TBG-Cre，只在成熟肝實質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)Cre，目前被認(rèn)為是肝細(xì)胞特異性敲除的金標(biāo)準(zhǔn)。 | |
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Alb-CreERT，除了在肝前體細(xì)胞內(nèi)的短時轉(zhuǎn)錄活性外，誘導(dǎo)劑他莫昔芬有一定肝毒性，可引起肝細(xì)胞發(fā)生膽管反應(yīng)，降低肝細(xì)胞特異性。 |
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l 遠(yuǎn)超慢病毒和腺病毒的超高肝臟感染效率
表2. 三種病毒的參數(shù)比較
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腺相關(guān)病毒載體 |
腺病毒載體 |
慢病毒載體 |
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病毒參數(shù) |
無包膜 直徑20~30nm ssDNA病毒 基因組4.6~6kb |
無包膜 直徑70~90nm dsDNA病毒 基因組25~45kb |
有包膜 直徑90~110nm dsRNA病毒 基因組~9kb |
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感染整合 |
不整合到宿主細(xì)胞基因組 |
不整合到宿主細(xì)胞基因組 |
隨機(jī)整合至宿主細(xì)胞基因組 |
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表達(dá)穩(wěn)定性 |
長時間穩(wěn)定表達(dá) |
瞬時表達(dá)，不穩(wěn)定 |
長時間穩(wěn)定表達(dá) |
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安全性 |
低免疫原性 不整合至宿主基因組，不會誘發(fā)基因失活或激活癌基因 |
高免疫原性 不整合至宿主基因組，不會誘發(fā)基因失活或激活癌基因 |
低免疫原性 隨機(jī)整合，可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因失活或癌基因被激活 |
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轉(zhuǎn)染效率 |
rAAV8對肝臟感染率可達(dá)100% |
小鼠肝臟感染率~60% |
小鼠肝臟感染效率低。 |
l 力克基因打靶技術(shù)的時間成本和技術(shù)難題
表3. AAV肝臟特異性和KO/KI小鼠比較
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AAV-TBG-GOI |
AAV-TBG-Cre |
cKO/KI |
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操作流程 |
1. 基因載體構(gòu)建（簡單） 2. AAV-TBG-GOI病毒制備 3. 尾靜脈注射 4. 開展下游實驗研究 |
1. 通過常規(guī)基因打靶技術(shù)獲得cKI/KO小鼠 2. AAV-TBG-Cre病毒現(xiàn)貨 3. 尾靜脈注射 4. 開展下游實驗研究 |
1. 基因載體構(gòu)建（復(fù)雜，工作量大） 2. 胚胎干細(xì)胞獲得 3. 同源重組，篩選陽性胚胎干細(xì)胞 4. 移植陽性胚胎干細(xì)胞至受體胚胎，得嵌合體小鼠 5. 至少經(jīng)過兩代遺傳獲得純合體小鼠 6. 與Alb-Cre或Alb-CreERT小鼠雜交，得雜合小鼠 7. 篩選鑒定，待小鼠成年，開展下游研究 |
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耗時 |
1個月獲得AAV-TBG-GOI病毒，尾靜脈注射后1-2周肝臟特異表達(dá)，即可開始下游實驗。 |
1-2周即可開始下游實驗 |
從Alb-Cre小鼠和cKI/KO小鼠雜交計算，至少需要2個月。 |
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條件要求 |
極低，提供基因名稱，即可獲得病毒 |
低，有cKI/KO小鼠，直接購買病毒即可 |
高，必須同時有cKI/KO小鼠和Alb-Cre（ERT）小鼠 |
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可控性 |
基因?qū)霑r間可控，基因表達(dá)細(xì)胞數(shù)量可通過病毒滴度控制 |
基因敲入/敲除時間可控，基因敲入/敲除細(xì)胞數(shù)量可通過病毒滴度控制 |
模型一旦構(gòu)建，基因敲入/敲除立即生效，所有細(xì)胞均一化，無法控制數(shù)量和比例。 |
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效果 |
肝細(xì)胞特異性表達(dá)外源基因 |
肝細(xì)胞特異性敲入/敲除靶基因 |
在肝臟敲除/敲入靶基因，特異性差（表1） |
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成本 |
低 |
低 |
高 |
