蒸發(fā)光散射檢測(cè)是目前中藥材檢測(cè)中常用的分析儀器，它是2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)黃芪甲苷檢測(cè)必不可少的儀器之一。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）工作原理

一、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD)的設(shè)計(jì)原理：

在輔助氣體作用下，將流動(dòng)相霧化，形成的液霧（霧珠）通過(guò)加熱而蒸發(fā)，此時(shí)溶解在流動(dòng)相中不易揮發(fā)的樣品即形成顆粒物，這些顆粒物由輔助氣體推動(dòng)進(jìn)入光束通道，造成光束散射。通過(guò)測(cè)定散射光的強(qiáng)度即可預(yù)測(cè)樣品顆粒的數(shù)量，從而測(cè)定樣品濃度。

二、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD)基本結(jié)構(gòu)：

依據(jù)ELSD的設(shè)計(jì)原理，ELSD的結(jié)構(gòu)由三大部分組成：即霧化霧珠處理，蒸發(fā)和散射光檢測(cè)。 第一步：霧化過(guò)程，也稱為噴霧過(guò)程。流動(dòng)相與輔助氣混合，在輔助氣的壓力作用下從一小孔中噴出而形成濃霧，整個(gè)裝置稱為噴嘴或稱霧化器。流動(dòng)相霧化后形成的液霧（霧珠）由于均勻性及一致性差，因此必須進(jìn)行處理，否則影響某其有效蒸發(fā)。此過(guò)程稱為分流。依據(jù)不同的分流方式，ELSD經(jīng)歷了三代發(fā)展。即限流器分流技術(shù)時(shí)代，撞擊器及低溫分流技術(shù)時(shí)代和熱分流技術(shù)時(shí)代。在第二代分流技術(shù)時(shí)代，依據(jù)所使用的分流技術(shù)不同，出現(xiàn)了兩大類的ELSD，即常說(shuō)的A型和B型。A型ELSD以撞擊器分流技術(shù)設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)分流和不分流兩種操作模式；B型ELSD，以低溫分流技術(shù)設(shè)計(jì)，只能實(shí)現(xiàn)分流操作，但由于其霧珠處理利用顆粒粒度方式分流，因而實(shí)現(xiàn)了低溫?fù)]發(fā)，特別有利于半揮性化合物的測(cè)定及高水相流動(dòng)相的應(yīng)用。

A、B類型其區(qū)別在于：類型A的操作是全部柱流出物都進(jìn)入直的漂移管，讓流動(dòng)相在其中蒸發(fā)；類型B的操作是把柱流出物通過(guò)一個(gè)彎管，在此管中大的顆粒沉積下來(lái)流入廢氣管，其余的小顆粒進(jìn)入螺旋狀的蒸發(fā)管。Wilcox考察了這兩種類型的ELSD，他認(rèn)為類型A的ELSD把所有的氣溶膠都送到漂移管中，為了有利于蒸發(fā)常常使用較高的操作溫度，因此它適合于檢測(cè)不揮發(fā)的樣品，使用流速為1.0ml/min（或更低流速）的揮發(fā)性流動(dòng)相進(jìn)行分析。類型B的ELSD將大顆粒氣溶膠撞在彎曲管管壁上除去，使氣溶膠粒度分布變窄，在較低的溫度下易于蒸發(fā)，適合于檢測(cè)半揮發(fā)性樣品，以流速為1.5ml/min（或更高流速）的高含水流動(dòng)相進(jìn)行分析。

第二步：蒸發(fā)，經(jīng)過(guò)第一部處理的霧珠進(jìn)一步流向經(jīng)加熱處理的區(qū)域，此時(shí)霧珠在熱的作用下不斷揮發(fā)形成氣體，揮發(fā)性差的樣品從流動(dòng)相霧珠中析出而形成顆粒物。這一裝置稱為蒸發(fā)區(qū)或漂移管。漂移管也有兩種設(shè)計(jì)方式，即螺線管式和直管式設(shè)計(jì)。螺線管有更長(zhǎng)的漂移距離，能更好的實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)，但隨著流動(dòng)相所經(jīng)距離的延長(zhǎng)，峰形變寬，靈敏度降低，且漂移管不方便維護(hù)，而直管則有更窄的峰，相對(duì)靈敏度提高，且維護(hù)方便。

第三步：檢測(cè)，監(jiān)測(cè)區(qū)由光源和光檢測(cè)器組成，光源經(jīng)光學(xué)處理后形成一束光，穿過(guò)漂移管末端口，氣體經(jīng)過(guò)光束時(shí)，不會(huì)影響光的穿透，而當(dāng)樣品顆粒經(jīng)過(guò)時(shí)，光即產(chǎn)生散射。散射出來(lái)的光照在90度位置上的光檢測(cè)器即產(chǎn)生廣電信號(hào)。在這里，光源有激光器、LED和鎢鹵燈。

激光器：光源強(qiáng)度大，發(fā)熱少，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊光學(xué)聚光文件。壽命長(zhǎng)。
LED：發(fā)熱少，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，強(qiáng)度弱，須進(jìn)行聚光等光學(xué)處理。
鎢鹵燈：發(fā)熱大，強(qiáng)度弱，須進(jìn)行聚光等光學(xué)處理，波長(zhǎng)范圍寬。
散射監(jiān)測(cè)器其實(shí)應(yīng)與光源配合使用，對(duì)于激光器，由于光強(qiáng)度大，其散射光強(qiáng)度也強(qiáng)，常用光電二極管作為檢測(cè)器，而對(duì)于光強(qiáng)較弱的光源，必須使用光電倍增管作為檢測(cè)器。
光電二極管：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小，無(wú)特殊供電路，故障率低。
光電倍增管：體積較大，需供高壓，故障率高，放大倍數(shù)可控制，可檢測(cè)低強(qiáng)度光。

三、 ELSD特征：

依據(jù)ELSD原理，ELSD是一類廣譜性、通用型質(zhì)量檢測(cè)器，幾乎所有揮發(fā)性低的化合物均可被檢測(cè)，且ELSD是質(zhì)量型檢測(cè)器，只與待測(cè)物的量有關(guān)，而與其光學(xué)特性，電化學(xué)特征及化合物本身的組成無(wú)關(guān)。

四、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD)的檢測(cè)原理

盡管ELSD有兩種檢測(cè)模式，但其檢測(cè)原理是相同的。Charlesworth奠定了ELSD檢測(cè)的理論基礎(chǔ)。Mengerink等系統(tǒng)地總結(jié)如下：

1）霧化   色譜柱流出進(jìn)入霧化器后，與充入的氣體混合形成液滴，液滴的平均直徑D0可以用Nakiyama和Tanasawa提出的公式計(jì)算：
D0=0.585×Sqr(σ)/( Δμ*sqr(ρ))+212(η/σ*ρ)＾0.45*（(1000×FL/Fg)＾1.5）
其中D0為表面積體積平均直徑（μm），為洗脫液的表面張力（N/m）；Δμ為液體和氣體之間的線速差（μm/s）；η為柱流出物的粘度（Pa.s）；ρ為柱流出物的體積質(zhì)量（Kg/m）；FL/Fg為柱流出物與氣體的流速比。最初的液滴直徑分布為高斯分布或非對(duì)稱的正態(tài)分布。

2）漂移 液滴進(jìn)入漂移管后揮發(fā)。液滴進(jìn)入到加熱的漂移管中，至少有三個(gè)現(xiàn)象發(fā)生：易揮發(fā)的部分蒸發(fā)；一些顆粒落到漂移管的管壁上；一些顆粒凝結(jié)在一起。Charlesworth提出了計(jì)算柱流出物蒸發(fā)時(shí)間的公式：
Td=ΔHVρD0＾2/MvKfΔT
其中td為完全揮發(fā)的時(shí)間；ΔHV/M為摩爾揮發(fā)度；ΔT為霧化氣體與液體表面的溫度差；Kf為液滴周圍氣體薄層的熱導(dǎo)率。
當(dāng)溫度上升到一定程度，被分析物（a）會(huì)同流動(dòng)相一道揮發(fā)，因此最佳溫度為tdm < td <tda。但為了減少顆粒在漂移管管壁上的沉淀，td的選擇最好是比tda略高一點(diǎn)。FL/Fg增大會(huì)使顆粒間更容易凝結(jié)。

3）在可以忽略漂移管管壁上的沉淀或平均直徑不被其它因素改變的前提下，進(jìn)入光散射池的氣溶膠中的顆粒直徑d與被分析物在洗脫液中的濃度C成正比：
d∝ D0 （ c/ρa(bǔ)）＾（1/3）             (*)
其中：ρa(bǔ)為被分析物的體積質(zhì)量。
對(duì)于軸心式的霧化器，當(dāng)被分析物的質(zhì)量濃度為1mg/L時(shí)，被分析物顆粒的大小處在米氏散射區(qū)域。根據(jù)米氏理論，散射光強(qiáng)度I可以表示為：
I=knd2（d/λ）＾y
其中：k為常數(shù)；n是散射區(qū)域中顆粒的數(shù)目；λ為檢測(cè)波長(zhǎng)；隨著d/λ的增加，y值從4.0減小到-2.2。當(dāng)λ和n為常數(shù)，散射光強(qiáng)度以d^p（p<6）指數(shù)增加，根據(jù)(*)式，散射光強(qiáng)度以c^q（q<2）指數(shù)增加。

根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)顯示，ELSD的相應(yīng)值（Y）與被測(cè)物濃度（X）的關(guān)系曲線比較復(fù)雜。在較高濃度范圍內(nèi)，大致呈線性；而在低濃度范圍內(nèi)，則大致呈指數(shù)關(guān)系，即Y=Ax^b，其中的b值往往為1-2（與理論相符）；另有少數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，響應(yīng)值與被測(cè)物濃度呈二次函數(shù)關(guān)系，即Y=aX+Bx^2。

⑷校正曲線和檢測(cè)限
當(dāng)被分析物在洗脫液中的濃度較低時(shí)，被分析物濃度值的對(duì)數(shù)與響應(yīng)值的對(duì)數(shù)的校正曲線大致呈線性。檢測(cè)限可以通過(guò)公式算出：
末找到
其中mLOD為檢測(cè)限（g）；m為注入的被分析物的質(zhì)量（g）；N/H為噪音與峰高之比；x為校正曲線的斜率。
之后，Meeren等[建立了一個(gè)計(jì)算機(jī)模擬的ELSD檢測(cè)機(jī)理模型，其基本理論也是建立在米氏理論的基礎(chǔ)上。他們把影響ELSD的響應(yīng)的因素分成四組：載氣氣壓，霧化器的設(shè)計(jì)，流動(dòng)相的組成和流速都將影響到霧化過(guò)程；被分析物的濃度和密度等決定了進(jìn)入光散射池的氣溶膠中的顆粒的直徑；被分析物的折射指數(shù)，光源發(fā)出的光的強(qiáng)度和波長(zhǎng)，光電倍增管的位置等將影響到散射光強(qiáng)度；光電倍增管的靈敏度和入射光的強(qiáng)度決定了檢測(cè)的效率，即反映為實(shí)驗(yàn)者所觀測(cè)到的峰面積。

馮埃生等 和Trathnigg等考察了影響ELSD檢測(cè)性能的基本因素，他們發(fā)現(xiàn)漂移管溫度對(duì)基線水平和噪音的影響沒有明顯的規(guī)律性，溫度過(guò)低流動(dòng)相得不到充分揮發(fā)，使基線水平較高；溫度過(guò)高則可能帶來(lái)更大的噪音。氣體流速增大，使響應(yīng)值減小，故最佳氣速是在可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大檢測(cè)響應(yīng)值的最低氣體。流動(dòng)相中可以加入低于10mmol/L的揮發(fā)鹽來(lái)調(diào)節(jié)所需的酸度。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，峰面積和峰高的自然對(duì)數(shù)分別與濃度的自然對(duì)數(shù)有較好的線性關(guān)系。

此外，還有不少實(shí)驗(yàn)者在用ELSD檢測(cè)各種物質(zhì)時(shí)，不同程度地研究了影響ELSD檢測(cè)性能的基本因素，但其研究都不夠系統(tǒng)，而且沒有提出相應(yīng)的理論。

4. ELSD在HPLC中的應(yīng)用研究
ELSD在對(duì)類酯、表面活性劑、糖、氨基酸、 季銨鹽、高聚物、甾體化合物等物質(zhì)的檢測(cè)，以及藥物分析方面發(fā)揮著重要的作用。

歸納起來(lái)，這些物質(zhì)往往具有如下的特點(diǎn)：1.物質(zhì)本身不含生色團(tuán)或吸光系數(shù)不大，使用UVD檢測(cè)靈敏度很低。2.物質(zhì)組分復(fù)雜，組分間極性差異較大，分離需要進(jìn)行梯度洗脫，故RID幾乎不適用，短波長(zhǎng)UVD在梯度洗脫時(shí)常會(huì)發(fā)生基線漂移。使用ELSD檢測(cè)，可以克服這些困難。對(duì)于不含生色團(tuán)的物質(zhì)，ELSD可以不經(jīng)衍生，直接進(jìn)行檢測(cè)，從而避免了衍生帶來(lái)的誤差；ELSD在檢測(cè)過(guò)程中，將流動(dòng)相完全揮發(fā)，因此在梯度洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)。對(duì)不同物質(zhì)，ELSD響應(yīng)因子的變化比其他檢測(cè)器（如紫外檢測(cè)器）要小得多，在因缺乏標(biāo)準(zhǔn)品而無(wú)法做校正曲線的情況下，利用ELSD可以近似地提供不純物的定量測(cè)定。HPLC/ELSD的色譜條件與LC/MS是一致的，在脫機(jī)情況下，使用HPLC/ELSD可以為L(zhǎng)C/MS摸索色譜條件，節(jié)省使用昂貴的LC/MS系統(tǒng)的操作成本，而且可以方便地用LC/MS來(lái)分析檢測(cè)出的不純物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)判定。

五、流動(dòng)相為1ml/min時(shí)，霧化器氮?dú)饬髁亢推�移管溫度與流動(dòng)相組成的關(guān)系。
單一流動(dòng)相 霧化器氮?dú)饬髁?漂移管溫度
環(huán)己烷 1.70 SLPM 70 ℃

氯 仿 1.65 SLPM 70 ℃

甲 醇 1.65 SLPM 70 ℃

乙 腈 1.70 SLPM 70 ℃

水 3.20 SLPM 115℃

混合流動(dòng)相: 按流動(dòng)相中混合溶劑的比率、計(jì)算混合流動(dòng)相所需的霧化器氣體流量和漂移管溫度。例如以60%甲醇/水為流動(dòng)相，其漂移管氣體流量=(0.60)(1.65)+(0.40)(3.20)=2.27 SLPM; 其漂移管溫度=(0.60)(70)+(0.40)(115)=88 ℃

梯度分離: 當(dāng)進(jìn)行梯度分離時(shí)，根據(jù)流動(dòng)相中最低揮發(fā)性的溶劑決定霧化器氣體流量和漂移管溫度。

注：提高流動(dòng)相流速，則應(yīng)相應(yīng)提高霧化器氮?dú)饬髁亢推�移管溫度；降低流�?dòng)相流速，則應(yīng)相應(yīng)降低霧化器氮?dú)饬髁亢推�移管溫度�?/FONT>