薄層色譜點樣

點樣方法

點樣除另有規(guī)定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑及點間距離同紙色譜法，點間距離可視斑點擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。樣品在溶劑中的溶解度很大，原點將呈空心環(huán)——環(huán)形色譜效應(yīng)。因此配制樣品溶液時應(yīng)選擇對組分溶解度相對較小的溶劑。點樣方式有點狀點樣和帶狀點樣。

怎樣提高點樣效率?

點樣是造成TLC定量誤差的主要來源。實驗證明：定量毛細(xì)管更適合較小體積的點樣；微量注射器更適合較大體積的點樣。這主要是因為微量注射器受小氣泡、溶液回爬現(xiàn)象的影響較大。為避免不同定量毛細(xì)管間的點樣誤差、建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細(xì)管。但應(yīng)注意更換樣品時，應(yīng)將毛細(xì)管用超1聲bo或不同極性溶劑清洗干凈。在制備樣品時，溶樣溶劑黏度不能過高，以便于點樣；溶劑沸點過低則進(jìn)樣體積易變，過高則會改變展開劑組成；對樣品溶解度過高會使樣點發(fā)生空心現(xiàn)象；常用的溶劑為甲醇、乙醇、**。經(jīng)典TLC樣點原點一般為直徑3mm點間距1--2cm 底邊距1.5cm；HPLC樣點原點一般為直徑1mm點間距5mm 底邊距1cm。

 不同溶劑對樣品的洗脫能力不同，因此在點樣的同時，樣品在原點開始呈環(huán)形展開，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點將變成空心環(huán)，Kaiser稱這種現(xiàn)象為“點樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。這種效應(yīng)對隨后的線形展開造成不良影響，因此配制樣品溶液時應(yīng)選用對組分溶解度相對較小的溶劑；溶劑的粘度不宜過高，以便于點樣，溶劑的沸點要適中，沸點過低由于揮發(fā)會改變樣品溶液濃度導(dǎo)致較大誤差，沸點過高，樣品溶液的溶劑會在原點殘留，導(dǎo)致改變展開劑的選擇性，特別是樣品溶液的溶劑與展開劑的極性相差較大時更為明顯，最常用的溶劑為甲醇及乙醇，有時也用丙酮。點樣后必須將溶劑全部除去后再進(jìn)行展開，但要避免高溫加熱，以免改變待測成分的性質(zhì)。（長沙德之瑞儀器科技有限公司定量毛細(xì)管）

點樣方式、點樣量及點樣設(shè)備的選擇決定于分析的目的、樣品溶液的濃度及被測物質(zhì)的檢出靈敏度。

點樣體積經(jīng)典薄層一般為1-5μl，高效薄層為100-500nl，樣品溶液濃度一般在0.01%-1.00%范圍內(nèi)，點樣過多會造成原點“超載”，展開劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象使斑點拖尾或重疊，使掃描峰形不對稱或不能基線分離，并由于超載得到非線性的校正曲線，嚴(yán)重影響定量結(jié)果，降低準(zhǔn)確度。

經(jīng)典薄層的原點直徑最大不得超過5mm，一般3mm較為合適，高效薄層原點直徑約為1-2mm，盡可能避免多次點樣，原點直徑過大會降低分辨率及分離度。

經(jīng)典薄層起始線距底邊約1.5cm，高效薄層為1cm，展距前者為10-15cm，后者為5-7cm，對于難分離的化合物用多元展開劑展開時，注意原點與展開劑的距離每次要保持一致，否則由于色譜分離最初行為的差異而導(dǎo)致分離失敗。

點與點的間距經(jīng)典薄層為1-2cm，高效薄層為0.5cm，用具自動換行功能的薄層掃描儀時，斑點之間的距離必須十分精確，才能正確地掃描每行的色斑，得到好的測定結(jié)果，圖7-3-1為一般的點樣圖解。

在點樣前，應(yīng)將薄層板在日光及紫外光下檢查板面有無損壞或污染，選擇合格的薄層板后決定用點狀點樣還是用帶狀點樣。為此，瑞士CAMAG公司生產(chǎn)了系列點樣設(shè)備以供選用，這些設(shè)備只適用于硬板。下面是常用的點樣方式及設(shè)備。 （長沙德之瑞儀器科技有限公司定量毛細(xì)管）

（一）點狀點樣
    如果僅僅為了定性，用內(nèi)徑約0.5mm管口平整的毛細(xì)管或微量注射器將樣品溶液點在距薄層底邊約2cm處，點樣直徑不超過5mm，點間距約為1-1.5cm即可。
    為進(jìn)行定量，借毛細(xì)作用吸樣的定容管有兩種，一是容積為0.5、1、2、3、4及5μl的德之瑞定量毛細(xì)管（Microcaps），另一種是100及200nl的鉑銥合金定量毛細(xì)管（Nanopipette）；注射器式的可變體積的點樣器有50-230nl的毫微點樣器（Nano-Applicator）及0.5-2.3μl的微量點樣器（Micro-Applicator），用于需要調(diào)節(jié)體積及沒有毛細(xì)作用的鍵合相薄層的點樣。
    毛細(xì)管式的微量點樣器裝在手動的Nanomat型點樣裝置的磁性點樣頭上，點樣頭裝在彈簧上。按下此點樣頭，毛細(xì)管借恒定的壓力接觸薄層表面。點間距離由帶準(zhǔn)確的#44 間隔的E字形缺刻裝置控制，CAMAG Nanomat Ⅲ型手動點樣器，適用于普通或高效薄層板，點樣體積精確，樣品原點小，原點間隔定位準(zhǔn)確；注射器式的毫微點樣器及微量點樣器由測微尺控制，也可與Nanomat型點樣裝置配合，以使點樣位置精確。
    電動的Nanomat Ⅲ型點樣裝置完全適用于上述各種點樣器的配套使用，并且還可以自動控制點樣次數(shù)，點樣器在薄居上的停留時間，以及點樣器接觸薄層的速度。還可避免手持毛細(xì)管點樣時的用力不勻，由于靠機(jī)械控制接觸板面，壓力恒定。此外，還有可以用于環(huán)形展開及向心展開的薄層點樣裝置。

（二）帶狀點樣
    當(dāng)樣品溶液體積大、濃度稀時，采用CAMAG Linoamt Ⅳ型自動點樣設(shè)備進(jìn)行帶狀點樣。定量分析的點樣范圍為1-99μl，制備型分離點樣范圍為5-490μl，作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線時，可由同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，自動點上不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液，故快速簡便，利用內(nèi)裝的微處理器編序操作，簡單易行。使用時樣品溶液吸在微量注射器中，點樣器不接觸薄層，而是用氮氣將注射器針尖的溶液吹落在薄層上，薄層板在針頭下定速移動點成0-199mm的窄帶。帶狀點樣展開后的斑點不僅分辨率明顯高于點狀點樣，而且精密準(zhǔn)確，為定量分析提供最佳條件。

（三）自動點樣
    Automatic TLC Sampler Ⅲ型（ATS Ⅲ）全自動點樣裝置結(jié)合了現(xiàn)代最先進(jìn)的電子及機(jī)械技術(shù)，能進(jìn)行點狀或帶狀點樣，采用先進(jìn)計算機(jī)編程控制，靈活多用，點樣量為10nl-50μl，可隨意設(shè)定點樣規(guī)范，可應(yīng)用于單向、雙向、環(huán)形或向心色譜展開，高度自動化的點樣使定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。點樣參數(shù)可與Scanner Ⅱ掃描儀的CATS掃描分析軟件連用，令定量分析工作達(dá)到高度自動化。

（四）接觸點樣
    當(dāng)樣品溶液粘度較大或點樣體積要超過100μl時，用毛細(xì)管點樣就有困難，F(xiàn)enimore設(shè)計的接觸點樣法適用于這類樣品的點樣，美國制造的Clarke Contact Spotter就是這種接觸點樣器，見圖7-3-2。在帶有抽氣孔的凹形塊的上方覆蓋一片涂有疏水性物質(zhì)的聚氟化物薄膜（a），當(dāng)減壓抽氣時薄膜凹陷（b），此時將樣品溶液點在凹槽處（c），然后用氮氣吹去大部分溶劑（d），再將濃縮后的樣品液滴與高效薄層板的吸附劑層接觸（e），此時樣品就定量地轉(zhuǎn)移到薄層上。

    1988年Kaiser對以上各種點樣方式進(jìn)行了比較，總結(jié)其優(yōu)缺點見表7-3-1、圖7-3-3。

這種微量快速的上樣方法，對天然化合物及合成高分子化合物的分離和鑒定已成為一個重要的手段。下村等在中藥厚撲鑒別的研究中應(yīng)用了此法，只需少量樣品即可鑒別厚撲酚（honokiol）；橋本庸平等用此法分離了麻黃堿的旋光異構(gòu)體，管內(nèi)殘渣經(jīng)生物堿檢查呈陰性，證明加熱后麻黃堿的揮發(fā)是完全的。Jolliffe等將含有某些生物堿的藥物，如烏頭、檳榔、顛茄、金雞納、麥角、曼陀羅、麻黃、天仙子、罌粟、蘿芙木、番木鱉等31種植物藥進(jìn)行熱微量抽出法，逸出的揮發(fā)性成分直接點在薄層上，用五種不同展開劑展開，用羅丹明B及奶油黃為參比物，顯色后對所分離的生物堿進(jìn)行鑒定。Cheml等將金雞納樹皮中的生物堿在爐溫300℃時揮發(fā)至硅膠板上，展開后鑒定辛可寧等七種生物堿。Van Meer等成功地用本法分離了纈草根中的纈草素及異纈草素。Liptak等用本法檢驗洋茴香、洋甘菊和歐薄荷以及它們的精油類成分。

圖7-3-9為FE-TLC示意圖，從高壓氣瓶1出來的氣體，通過電動隔膜壓縮器6壓至7.0-40MPa，壓縮器和微量萃取器12在恒溫器內(nèi)保持恒溫。萃取器的體積為2ml，被萃取樣品置在其中。先關(guān)閉閥門11，待高壓提取器內(nèi)氣壓達(dá)到提取壓力，提取過程達(dá)到平衡后即打開。超臨界流體通過一毛細(xì)管噴出。由于氣流壓力下降至大氣壓，帶出的提取物析離并吸附在薄層板13上，薄層板與毛細(xì)管出口間距離為1-5mm。點樣后按薄層常規(guī)方法操作。通過分步提高提取壓力，可以分步提出不同成分。

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