細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)在同一環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)，更好的模擬體內(nèi)細(xì)胞互相通信的生理情況。一般有兩種共培養(yǎng)方法：1）直接接觸共培養(yǎng)體系：是指直接將2種或2種以上的細(xì)胞按照一定比例混合，鋪在一個孔中；2）間接接觸共培養(yǎng)體系：是指將不同種類的細(xì)胞共用一種培養(yǎng)環(huán)境，而不互相接觸，查看細(xì)胞分泌因子對另外的細(xì)胞的影響。這里我們介紹的是采用間接接觸共培養(yǎng)的方法，研究CD34祖細(xì)胞的分泌物對由內(nèi)皮細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)在血管形成上的影響。

文中，研究人員將CD34祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，CD34祖細(xì)胞使內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)血管生成的出芽長度增長了18%，如果在此基礎(chǔ)上將氧濃度從20%降低到1%，血管生成的出芽長度增長了52%。說明CD34細(xì)胞和低氧情況都會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的發(fā)生。

Paracrine effects of CD34 progenitor cells on angiogenic endothelial sprouting

R. J. Scheubel, J. Holtz, I. Friedrich, J. Borgermann, S. Kahrstedt, A. Navarrete-Santos, R. E. Silber and A. Simm

International Journal of Cardiology, 2008, 10.1016/j.ijcard.2008.10.009

實(shí)驗(yàn)材料：

1. CD34細(xì)胞
2. HUVEC細(xì)胞團(tuán)         1000個細(xì)胞/團(tuán)
3. Collagen Gel
4. ECGM                內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基
5. 共培養(yǎng)載玻片（圖一）          德國ibidi公司，81806

圖一：ibidi共培養(yǎng)載玻片特點(diǎn)，可見載玻片上有2個大孔，可以做兩組平行實(shí)驗(yàn)。其中每個大孔中有9個小孔�？梢苑謩e鋪不同的細(xì)胞，細(xì)胞互相分開而生長在同一個培養(yǎng)環(huán)境中。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）將共培養(yǎng)載玻片上其中一個大孔中的9個小孔分為三列：最左邊一列鋪入 7×104 的CD34祖細(xì)胞，中間和右邊兩列均按照每孔7個HUVEC細(xì)胞團(tuán)與collagen gel相混鋪入每個孔中（圖二）。

圖二：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖示。設(shè)計(jì)成三列可以對比不同濃度梯度下由CD34細(xì)胞旁分泌的細(xì)胞因子對細(xì)胞團(tuán)血管生成的影響。

1. 對照組為第一列不加入任何細(xì)胞，但仍使用collagen gel作為細(xì)胞基質(zhì)在剩下兩孔中加入HUVEC細(xì)胞團(tuán)。
2. 低氧測試，將鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板再分為兩組，一組放入20%氧含量環(huán)境中37℃孵育30分鐘，另一組放入1%氧含量環(huán)境中37℃孵育30分鐘。
3. 在每個大孔中加入500μl內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECGM），并繼續(xù)在相應(yīng)的環(huán)境中培養(yǎng)24小時。
4. 以10%多聚甲醛終止實(shí)驗(yàn)，并且每列至少選擇10個細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行血管生成出芽方向和長度的測量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 細(xì)胞團(tuán)血管生成形態(tài)對比（圖三）：

圖三： 有CD34祖細(xì)胞存在的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)的血管生成出芽具有方向性，而空白對照出芽沒有方向性。

2.出芽長度對比（圖四）：

圖四：a）無CD34的存在時，低氧環(huán)境使得血管生成出芽長度有顯著的提升。B）在同樣濃度下，CD34祖細(xì)胞也會使內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)的出芽長度有顯著的提升。

3.20%氧濃度下，與CD34細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)血管生成出芽方向結(jié)果（圖五）：

圖五：在有CD34祖細(xì)胞的存在下，離CD34細(xì)胞近的細(xì)胞團(tuán)血管生成出芽展現(xiàn)出一個方向特異性。

4）1%氧濃度下，與CD34細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)血管生成出芽方向結(jié)果（圖六）

圖六：在低氧的環(huán)境中，內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)對CD34祖細(xì)胞同樣有方向敏感性，離CD34細(xì)胞近的細(xì)胞團(tuán)血管生成出芽展現(xiàn)出一個方向特異性。