Q-PCR實驗流程

一、 ①實驗前準備，每天早上到實驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開15-20分鐘。②超凈臺前做實驗，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。③取EP管/槍頭時需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完EP管/槍頭后，袋子及時封好。④橡膠手套須放入超凈臺照射紫外，實驗操作過程中不得帶出超凈臺，移液器在一天工作結束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。⑤實驗進行的過程中或觀看實驗時，沒有帶口罩不要在超凈臺前講話。

二、 總RNA抽提

1)細胞培養(yǎng)皿中細胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混勻，并吸至1.5ml RNase free EP管中使細胞充分裂解，室溫靜置5min;

如使用組織樣品，則先用液氮充分研磨組織樣品，然后加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解;(管蓋與管壁都需標記樣品名稱)

2)加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3-5min;(離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致)

3) 4℃下，14,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的RNase free EP管;(用20-200ul的槍吸取上清，吸上清時，槍頭應沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層)

4)沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次)(不應用振蕩器混勻)，室溫靜置10min;

5)4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀(如離心后仍不見EP管底部有沉淀，應將EP管放置在-80度冰箱過夜，繼續(xù)在4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀)，去上清;

6)用75%乙醇洗滌兩次(12,000g離心5min)(加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀)，超凈臺風干;沉淀不能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇殘留。

7)視沉淀量加入適量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

三、去基因組

使用RNase-free的DNase І(Promega)，按以下體系配置反應液，37℃消化30min，65℃滅活10min。

RNA  DNase І  10 x buffer  H2O(RNase free) RNasin	30 20 10 39.5 0.5	µl µl µl µl µl
總體積	100	µl

然后按以下步驟操作：

1) 加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5min后， 14,000rpm離心15min，取上清。

2) 加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm，離心15min，取上清。

3)加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次)，-20℃靜置15min;

4)4℃下，14,000g離心15min，收集RNA沉淀，去上清;

5)用75%乙醇洗滌兩次(12,000g離心5min)，超凈臺風干;

6)加入適量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

四、總RNA純度和完整性檢測

1)純度檢測：取1μl RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。

2)總RNA完整性檢測：取RNA樣品1μl，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20min，EB染色10min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。

五、逆轉(zhuǎn)錄

1. mRNA：

1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液.

 

Total RNA  H2O	1.0	µg µl
總體積	12	µl

2) 將上述溶液吹打均勻，置85℃保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷， 以防止RNA復性;

3) 在該PCR管中加入下列試劑(Promega)

oligo（dT） Random primer  10mM dNTP  RNase inhibitor  5 x buffer  M-MLV	0.5 0.5 2.0 0.5 4.0 0.5	µl µl µl µl µl µl
總體積	8.0	µl

4) 將上述20μl反應溶液30℃保溫10min;

5) 42℃保溫50min;

6) 85℃保溫10min;

7) -20℃保存。

2. microRNA：

使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：

1) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液.

 

total RNA X個miR逆轉(zhuǎn)錄引物 H2O	1.0 0.5*X	µg µl
總體積	12.5	µl

 

 

 

2)將上述溶液混勻，85℃孵育5min，以打開RNA二級結構。隨后立即置于冰上，以防止RNA復性再次恢復二級結構;

3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：

10mM dNTP (promega)  RNase inhibitor (promega) U6逆轉(zhuǎn)錄引物 5x buffer  M-MLV (promega)	2.0 0.5 0.5 4.0 0.5	µl µl µl µl µl
總體積	7.5	µl

4) 將3)溶液加入到1)溶液中，混勻后30℃保溫10min;

5) 42℃孵育50min;

6) 85℃孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

四、定量PCR檢測

1.引物測試：

根據(jù)mRNA設計的引物正式實驗前需進行qPCR測試其特異性和擴增效率，具體反應體系和反應條件如正式實驗，每對引物需做模板水對照。

得到結果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標準為：單峰且峰形偏窄、水對照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。若設計的多對引物熔解曲線均顯示特異性良好，則應對比各引物的擴增曲線，優(yōu)先選擇Ct值小、擴增效率高的引物進行正式實驗。

2.確定上機內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機的樣品排放順序。(1)一個樣品的加樣盡可能安排在同一行(2)如正式實驗中三次重復不能安排在同一板上，則需把三次重復中的實驗分開，但同一次重復的實驗不能分開兩板

3.正式實驗：

體系配制：

H2O 4ul

SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)

上游引物 0.5ul (10uM)

下游引物 0.5ul (10uM)

總體積 15ul

計算好實驗中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會有損失，一般多配0.5份--1份體系。

總的體系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻，然后15ul每管分裝至8連管中。

3.cDNA用滅菌純水稀釋適當?shù)臐舛龋�一般�?:20稀釋，如遇到基因表達低的樣品，則適當降低稀釋比例至1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后，即可加至剛配好的反應體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標記好1-12的順序(不可將標記寫在反應管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復性或可能出現(xiàn)熔解曲線峰漂移。)

4.把各排八連管放在掌上離心機上離心數(shù)秒。

五.上機：

5.1 先開電腦，進入Windows 界面。接著打開PCR儀電源開關。

5.2 打開7500軟件，選擇“新建”，在“Template”下拉菜單中選擇“60”或“65”(普通基因檢測為“60”，MicroRNA檢測為“65”)

5.3 打開樣品架，放入八連管，關上樣品架，并在軟件上選擇已放反應管的孔位，剔除無反應管的孔位。

5.4 點擊File菜單中Save，輸入要保存結果的文件名，命名為日期-上機時間-客戶名字簡寫，如100830-1008-WL表示8月30日10點08分魏立的實驗。

5.5 點擊Start鍵，開始運行程序。

5.6 程序運行完畢后，取出樣品架上的八連管，按順序關閉ABI PRISM 7500 SDS 軟件、PCR儀電源開關。

5.7 在7500軟件上標記好每個反應孔的樣品名稱及檢測基因的名稱，分類保存好結果文件。

反應完成后，八連管應裝到封口袋中，袋子上標記好文件名，客戶的名字。(同一個客戶的三次重復實驗，則只需保存其中一次重復的反應管即可，其余可丟棄)