細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及可能原因的建議解決方案

• 培養(yǎng)基pH值變化迅速

1. 培養(yǎng)箱CO2分壓設(shè)置錯誤---根據(jù)培養(yǎng)基中NaHCO3的濃度增大或降低培養(yǎng)箱CO2的分壓，NaHCO3濃度為2.0-3.7g/L時，應(yīng)相應(yīng)地使用5%-10%的CO2分壓
2. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋過緊---將瓶蓋旋松1/4圈
3. 碳酸氫鹽緩存系統(tǒng)緩沖能力不足---加入HEPES緩沖液，使其終濃度為10-25mM
4. 培養(yǎng)基中鹽含量不正確---CO2平衡環(huán)境中使用以Earle平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hanks平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基
5. 細(xì)菌、酵母或真菌污染---將細(xì)胞和培養(yǎng)基滅菌處理后丟棄

• 細(xì)胞無法在培養(yǎng)器皿上貼壁生長

1. 細(xì)胞胰酶消化過度---縮短胰酶消化時間或減少胰酶用量
2. 支原體污染---隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄
3. 培養(yǎng)基中無附著因子---如果使用的是無血清配方，應(yīng)確保含有附著因子或者使用經(jīng)過包被的培養(yǎng)板

• 懸浮細(xì)胞聚集成團

1. 存在鈣離子和鎂離子---用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液
2. 支原體污染---隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄
3. 蛋白水解酶消化過度導(dǎo)致細(xì)胞裂解、DNA釋放  用0.001%DNA酶I處理細(xì)胞；用PBS沖洗后再接種到新培養(yǎng)基中

• 細(xì)胞生長緩慢

1. 培養(yǎng)基或血清改變---比較不同培養(yǎng)基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有無差異；通過生長實驗比較新老批次血清有無差異；增大細(xì)胞初始接種密度；使細(xì)胞逐步適應(yīng)新的培養(yǎng)基
2. 必需生長促進(jìn)成分（如L-谷氨酰胺或生長因子）耗竭、缺乏或分解---去除原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中添加生長促進(jìn)成分（如L-谷氨酰胺）
3. 輕度細(xì)菌或真菌污染---在不添加抗生素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄
4. 時間存儲不當(dāng)---血清應(yīng)于-5℃至-20℃下儲存；培養(yǎng)基應(yīng)于2℃~8℃下避光儲存；盡量減少血清和培養(yǎng)基見光時間
5. 細(xì)胞初始接種密度低---增大活細(xì)胞接種密度
6. 細(xì)胞衰老、老化---將老化細(xì)胞丟棄，取用代數(shù)較少的細(xì)胞
7. 支原體污染---隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄

• 細(xì)胞死亡

1. 培養(yǎng)箱中無CO2---監(jiān)測培養(yǎng)箱中CO2使用速度以便確定及時更換氣瓶；經(jīng)常檢測管路連接處是否漏氣；不要頻繁開啟培養(yǎng)箱門
2. 培養(yǎng)箱內(nèi)溫度有波動---監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，及時校正
3. 使用抗生素達(dá)到毒性濃度---減少抗生素的用量；使用無血清培養(yǎng)基時，抗生素濃度應(yīng)降低至1/10
4. 細(xì)胞復(fù)蘇或凍存時受到損傷---取用新的細(xì)胞
5. 培養(yǎng)基的滲透壓不合適---檢查完全培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞可耐受260-350mOsm/kg的滲透壓，加入某些試劑和藥物后會影響培養(yǎng)基的滲透壓；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓（340~380mOsm/kg）要高于哺乳動物細(xì)胞
6. 培養(yǎng)基中毒性代謝產(chǎn)物蓄積---去除原培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基