細胞凍存和復蘇

細胞凍存后可保存種子細胞，以便隨時取用；減少細胞被微生物污染的危險性；減少細胞之間交叉污染的危險性；減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變；避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。凍存細胞前，應對細胞進行鑒定并檢查是否被污染。

細胞凍存及復蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性；緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。需要特別注意的是DMSO 稀釋時會釋放大量熱量，因此DMSO 不能直接加到細胞液中，必須事先配制。

• 細胞凍存

1. 細胞凍存前12-24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細胞一直處于對數(shù)生長期。
2. 待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。
3. 棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度為3×10^6-1×10^7cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1-1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。
4. 按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過夜，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要更換一次，以免影響凍存效果。
5. 細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存。

• 細胞復蘇

凍存細胞十分脆弱，必須輕柔操作。除少數(shù)對冷凍保護劑（DMSO或甘油）敏感的細胞，絕大部分細胞在解凍之后，可直接接種到完全培養(yǎng)基中，隔天再換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 和死細胞，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼壁的問題，也可因不離心，減少了操作步驟，降低污染的幾率。

1. 將凍存細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，輕輕晃動凍存管，使細胞能在1-2min內(nèi)完全解凍，盡快通過最易受損的溫度段（-5-0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。
2. 用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至裝有完全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)制成細胞懸液。進行活細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至少為3×10^5個活細胞/mL。
3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
4. 第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO和死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80-90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2-3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。