1. 細(xì)胞的準(zhǔn)備

a) 復(fù)蘇293細(xì)胞，傳代培養(yǎng)1-2代，調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)，務(wù)必4代以內(nèi)完成轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

b) 在轉(zhuǎn)染前1天，用胰酶消化傳代，將5×105細(xì)胞接種于6孔板或87.5px皿中，加入2ml完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax），搖勻后置于5% CO2、95% 濕潤空氣、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以保證次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)70%左右。

2.  轉(zhuǎn)染

a) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，從293細(xì)胞中移除培養(yǎng)基，分別換上新鮮的1.8ml DMEM+10%FBS培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃孵育2h。

b) 配制轉(zhuǎn)染試劑混合物

c) 使用轉(zhuǎn)染試劑POLO3000：

d) A管：將4ug DNA與 100ul DMEM（基本），混勻；

e) B管：將6ul POLO3000與100ul DMEM（基本），混勻；

f) 室溫放置5min后，將A管與B管溶液混合，輕輕混勻室溫孵育15-20min；

g) 將上述復(fù)合物均勻滴加到293細(xì)胞中，輕輕搖勻細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱中孵育。

3. 腺病毒包裝

a) 轉(zhuǎn)染24-48h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若質(zhì)粒帶熒光，可熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，此時(shí)熒光率約10-70%。細(xì)胞密度高于>90%需進(jìn)行轉(zhuǎn)盤，用胰酶消化細(xì)胞全部傳到250px細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

b) 此后每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，每隔2天換一次培養(yǎng)基，每次換液8ml，直至有病斑（CPE）出現(xiàn)，之后換液采取半換即留3ml，再補(bǔ)5ml。

c) 傳代后的第7-10天，細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中出現(xiàn)60%的CPE，大部分細(xì)胞崩解脫落，將細(xì)胞和培養(yǎng)液全部收集。

4. 腺病毒粗液的制備

a) 將收獲的裝有細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞碎片的離心管放于-80°C冰箱中。30min后，將管子放置于37°C水浴鍋中，解凍15min，如此反復(fù)凍融兩次以裂解細(xì)胞。

b) 將反復(fù)凍融的病毒液4℃ 3000rpm 離心15min，去除細(xì)胞碎片。

c) 將病毒粗提液1 ml/管分裝于1.5ml離心管中，保存于-80°C冰箱。

5. 3.5  腺病毒液濃縮

a) 將上一步驟的病毒上清用0.45um的醋酸纖維素膜過濾，在過濾病毒液之前先用5ml DMEM完全培養(yǎng)基過濾潤濕濾膜，以減少濾膜對病毒蛋白的吸附。

b) 將過濾之后的病毒液，置于Beckman高速離心管中，4℃，50000g，離心2h。

c) 離心完畢后，將離心管拿回安全柜中，小心傾倒上清，將離心管倒扣在吸水紙上瀝干殘液。

d) 取1ml預(yù)冷的DMEM，依次加入到離心管中，用剪去尖頭的槍頭，重復(fù)多次地半量吹打沉淀，輕柔操作，將離心管底部的沉淀完全重懸于DMEM溶液中，再用１ml DMEM潤洗各管一遍，共得2ml病毒濃縮液。

e) 每管100ul小量分裝與病毒專用管中，置-80度保存。

持續(xù)發(fā)布中......