1 菌液的準(zhǔn)備

1.1. 取含目的質(zhì)粒的甘油菌液（-80℃或-20℃冰箱中），待菌液融化后，在超凈臺(tái)用接種環(huán)劃線于氨芐抗性的平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。待平板長(zhǎng)出菌落，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單克隆菌落。若無(wú)目的質(zhì)粒的菌液，則需取庫(kù)存質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后挑單克隆搖菌。

1.2. 將單克隆接種于5ml氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm/min，震蕩培養(yǎng)12-16h；  

1.3. 將上述的5ml LB菌液分裝到2個(gè)2ml離心管中5000g 離心8 min，棄上清（將離心管倒置于紙巾上數(shù)分鐘，除盡上清），細(xì)菌沉淀待用。

2 腺病毒質(zhì)粒的抽提（參考AxyPrep™ 質(zhì)粒小抽試劑盒說(shuō)明書(shū)）

2.1 取250ul 已加入RNase A 的Buffer S1 對(duì)細(xì)菌沉淀進(jìn)行懸浮，將細(xì)菌沉淀吹打需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。

2.2 取250ul Buffer S2加入到上述菌懸液中，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

2.3 取250ul 4℃預(yù)冷的Buffer S3加入到上述溶液中，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)10 次混合均勻，直至形成緊實(shí)的凝集塊，室溫放置5 min。

2.4 將上清轉(zhuǎn)移到小抽制備管中，4℃ 5000g 離心1min，然后將小抽制備管從2 ml 離心管中取出，棄離心管中的濾液。

2.5 將制備管放置回離心管，加0.5 ml Buffer W1，5000g 離心1 min，棄濾液。

2.6 將制備管放置回離心管，加0.7ml Buffer W2，5000g 離心1 min，棄濾液；同樣的方法，再用0.7ml Buffer W2 操作一次，棄濾液。

2.7 最后將小抽制備管置回2 ml 離心管中，12,000g 離心1 min，甩干酒精。

2.8 然后將小抽制備管取出，放置于潔凈的1.5 ml 離心管中（試劑盒內(nèi)提供），在小抽制備管的膜上均勻加60-80ul 的Eluent，室溫靜置1 min；然后12000g 離心1 min ，收集離心液，此為小抽質(zhì)粒初液，-20℃保存。

2.9 取適量質(zhì)粒初液進(jìn)行質(zhì)粒濃度測(cè)定，以備后續(xù)的質(zhì)粒酶切線性化試驗(yàn)。

3 腺病毒質(zhì)粒初液的酶切線性化

小抽質(zhì)粒經(jīng)PacI 線性化，體系如下：

37℃培養(yǎng)箱中酶切過(guò)夜（17-20h左右）。

4 線性化的腺病毒質(zhì)粒純化

4.1 將上述過(guò)夜酶切的產(chǎn)物短暫離心，轉(zhuǎn)移至已滅菌的進(jìn)口EP管內(nèi)；然后加入200 ul（等體積）氯仿，上下顛倒混勻， 12000 rpm離心10min。

4.2 小心吸取上層液體至新的已滅菌的進(jìn)口1.5mlEP管內(nèi)，加入1/10體積（上清體積）NaAc(3M pH5.2)及2.5倍體積的無(wú)水乙醇（-20℃預(yù)冷），上下顛倒混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的絮狀物即為DNA，-20℃中放置2-3h，13000 rpm離心15min。

4.3 棄上清，加入1ml 75%乙醇，手指輕彈EP管底部幾次，重懸沉淀， 8000 rpm離心5min，棄上清；重復(fù)此步驟。

4.4 重復(fù)步驟3.4.3，浸泡沉淀10min，離心后取出離心管，將離心管帶到細(xì)胞間生物安全柜內(nèi)操作，盡可能棄上清液（最好調(diào)低壓用泵吸，這樣又快又干凈，也可用10ul槍頭吸殘液，以免沉淀被吸走），在安全柜內(nèi)開(kāi)蓋晾干酒精，沉淀由白色變透明即可。

4.5 加入10-20ul滅菌ddH2O溶解沉淀，4℃溶解過(guò)夜，輕彈/用槍吹打均勻后，取出0.5 ul加至含2ul ddH2O（5倍稀釋）后電泳測(cè)定DNA濃度用于濃度的測(cè)定，其余質(zhì)粒-20℃保存。

4.6 計(jì)算質(zhì)粒濃度，做好記錄和標(biāo)記，-20℃保存。

腺病毒表達(dá)載體圖譜：

持續(xù)發(fā)布中......

參考鏈接:http://www.research-bio.com/h-col-159.html​