銳賽小課堂技術(shù)篇0626-108
一、實(shí)驗(yàn)流程（1和2為并列步驟）

1.慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)�；蛘呶膸�(kù)）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過(guò)超離心濃縮病毒。
二、實(shí)驗(yàn)材料
2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。
載體信息
1) 慢病毒克隆載體圖譜如下：

2） 包裝質(zhì)粒信息如下：
PMD2G載體圖譜和序列信息

PSPAX2載體圖譜和序列信息：

細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴(lài)型成上皮樣細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞。 菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。

三、流程圖

持續(xù)發(fā)布中......