成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)是最大的一類中胚層和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化多肽因子家族。FGFs在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，比如胚胎發(fā)育，傷口愈合，血細(xì)胞生成及血管發(fā)生等。此外，已有研究表明FGFs可以增加多種腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性，如前列腺、膀胱、腎臟、乳房、胰腺等部位腫瘤。

目前，共發(fā)現(xiàn)20多種FGFs，對(duì)不同類型細(xì)胞具有不同的作用。但是，只發(fā)現(xiàn)了5種FGF受體(FGFR)。在蛋白水平上，這些受體具有55%-72%的同源性。FGFR結(jié)構(gòu)包括一個(gè)胞外配體結(jié)合區(qū)域，一個(gè)跨膜區(qū)域以及一個(gè)胞內(nèi)激酶區(qū)域。配體結(jié)合區(qū)域包含三個(gè)不同的類似免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(稱為免疫球蛋白I，II和III)。FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成兩種亞型α和β。其中FGFR3具有兩種不同的突變體IIIb和IIIc。這兩種變體具有不同的親和活性：IIIc分布更加廣泛，能和多種FGFs結(jié)合(FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF4，和FGF9)；IIIb優(yōu)先和FGF1結(jié)合，能夠較低程度和FGF8和FGF9結(jié)合。在有肝素(heparin)作用的情況下，F(xiàn)GFs和FGFRs結(jié)合后，F(xiàn)GFs誘導(dǎo)受體二聚化，引起胞內(nèi)激酶區(qū)域的自身磷酸化以及下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。配體受體結(jié)合后，F(xiàn)GFs會(huì)啟動(dòng)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：胞內(nèi)鈣離子水平升高，誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸環(huán)化酶以及誘導(dǎo)原癌基因c-myc 和c- fos。

已發(fā)現(xiàn)FGFR3會(huì)發(fā)生特殊突變，導(dǎo)致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些與骨骼發(fā)育，多發(fā)性骨髓瘤，頸部腫瘤以及膀胱腫瘤相關(guān)的綜合征。最近的研究發(fā)現(xiàn)FGFR信號(hào)是前列腺腫瘤細(xì)胞在體外存活所完全必需的。近來，F(xiàn)GFR3已被作為多發(fā)性骨髓瘤的可能治療性靶點(diǎn)。盡管已有確實(shí)證據(jù)表明激活的FGFR3突變存在于腫瘤組織中，但是關(guān)于FGFR3在腫瘤組織中的表達(dá)知道的非常少。近來，使用基因芯片技術(shù)對(duì)基因表達(dá)分析后，發(fā)現(xiàn)和正常組織相比FGFR3在膀胱腫瘤樣品中過表達(dá)�；�因表達(dá)水平通過Western blot和免疫組化分析在蛋白水平上進(jìn)一步確證。事實(shí)上，這種蛋白的過量產(chǎn)生在過渡性腫瘤中似乎比基因突變更容易發(fā)生。所有這些數(shù)據(jù)都表明FGFR3可能是一個(gè)非常有吸引力的泌尿外科腫瘤的治療性靶點(diǎn)。膀胱腫瘤是生殖泌尿系統(tǒng)第二個(gè)最常見的惡性腫瘤之一。大約40%-50%的膀胱腫瘤表現(xiàn)出FGFR3基因發(fā)生突變；表皮腫瘤發(fā)生的概率(80%)比浸潤(rùn)性腫瘤更大。

隨著人們對(duì)FGFR3作為不同腫瘤治療性靶點(diǎn)的興趣越來越大，以及進(jìn)來發(fā)現(xiàn)它在過渡細(xì)胞瘤中的過度表達(dá)，我們已開始使用噬菌體展示技術(shù)開發(fā)用于治療的人源抗體。噬菌體抗體展示是目前最好的一個(gè)開發(fā)用于研究，臨床以及治療用途人源抗體的方法。但是，對(duì)于抗體開發(fā)來說，F(xiàn)GFR3分子非常難以琢磨，因?yàn)樾∈蠛腿说腇GFR3同源性非常高(92%)。僅最近，有報(bào)道通過使用一個(gè)庫(kù)容非常大(2.1*1010)的商業(yè)化Fab庫(kù)，開發(fā)出針對(duì)一個(gè)FGFR3亞型的Fab片段。在我們的試驗(yàn)中，我們使用了兩個(gè)公開的scFv抗體庫(kù)Tomlinson I + J (MRCGeneservices, Cambridge, United Kingdom)。兩個(gè)庫(kù)的庫(kù)容都大概在1.4*108。scFvs相比IgG以及Fabs具有更好的腫瘤浸潤(rùn)性，能夠更快速被清除，同時(shí)具有更好的特異性。在這篇報(bào)道中，我們已經(jīng)篩選出了一些對(duì)FGFR3a的亞型IIIc具有特異性的人scFv抗體。這些抗體通過FACS證明可以和膀胱腫瘤細(xì)胞系RT112發(fā)生反應(yīng)，并且抑制細(xì)胞增殖，具有進(jìn)一步用于治療的潛力。

 

RT112，HEK293；重組人FGFR3a（IIIc）/Fc，F(xiàn)GFR1a（IIIc）/Fc，F(xiàn)GF9，F(xiàn)GF1以及表皮生長(zhǎng)因子。鼠抗人FGFR3單克隆抗體，羊抗人IgG（Fc特異性），鼠抗c-myc單克隆抗體，微管蛋白抑制劑；HRP-抗c-myc抗體，抗6His抗體，抗M13抗體，HRP-抗M13單克隆抗體，F(xiàn)ITC-兔抗鼠IgG，R-藻紅蛋白羊抗鼠IgG，鼠IgG TrueBlot。

 

FGFR3的胞外區(qū)域和人IgG的Fc C端融合表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)WT-Fc和pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)S249C-Fc。然后，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。免疫印跡法和FACS檢測(cè)蛋白表達(dá)和活性。

 

人scFv噬菌體庫(kù)Tomlin-son I + J，輔助噬菌體KM13，E.coli TG1和HB2151。分別單獨(dú)培養(yǎng)兩個(gè)噬菌體庫(kù)，然后1:1混合噬菌體用于篩選。按照示意圖1所示，進(jìn)行噬菌體庫(kù)篩選和scFv表達(dá)。第一輪篩選，使用1ug FGFR3或人IgG蛋白包被微孔板。噬菌體先和人IgG孵育1小時(shí)去除可以和Fc發(fā)生反應(yīng)的噬菌體；再和FGFR3包被的孔孵育2小時(shí)。最后，微孔板使用0.1%PBST洗滌10遍(下一輪篩選洗滌20遍)，使用100ul胰蛋白酶處理微孔板，洗脫結(jié)合的噬菌體。洗脫獲得的噬菌體按照Goletz等描述的方法進(jìn)行另一輪的淘選。

 

圖1：噬菌體庫(kù)篩選FGFR3特異性scFv抗體流程圖

 

使用0.3ug的FGFR3，F(xiàn)GFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗滌，封閉，加入不同濃度前面篩選純化后的噬菌體懸浮液。孵育后，加入HRP-抗M13抗體，加入底物顯色，450nm讀取結(jié)果。

 

經(jīng)過兩輪或三輪的篩選后收獲的噬菌體經(jīng)過培養(yǎng)生長(zhǎng)出克隆，然后使用QPix高通量自動(dòng)化克隆篩選系統(tǒng)(Molecular Devices)挑取單克隆到含有100ul 2TY培養(yǎng)基的96微孔板，37度培養(yǎng)，第二天使用相同培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物1:100稀釋，然后37度震蕩培養(yǎng)2小時(shí)，加入25ul含有109輔助噬菌體KM13的2TY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。菌體經(jīng)過離心，重懸于2TY培養(yǎng)基，30度過夜培養(yǎng)。最后，離心，取50ul上清，進(jìn)行單克隆噬菌體ELISA分析。

 

獲得的高特異性克隆，使用E.coli HB2151誘導(dǎo)表達(dá)，離心收獲菌體，提取細(xì)菌周質(zhì)腔蛋白，最后使用親和色譜純化。純化的各組分使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析。純化的組分進(jìn)一步使用分子篩層析分離出scFv蛋白的單體(scFv容易發(fā)生二聚體或者多聚體)。

 

使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，并且計(jì)算獲得每個(gè)純化的scFv的Kd值；使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析確定每個(gè)scFv的特異性結(jié)合位點(diǎn)。使用同樣的方法分析scFvs和FGF9，F(xiàn)GF1以及EGF是否能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FGFR3。

 

使用流失細(xì)胞儀分析噬菌體scFv和純化后可溶性scFv在細(xì)胞水平上和FGFR3的結(jié)合活性。通過處理RT112細(xì)胞，然后使用共聚焦顯微鏡進(jìn)一步分析抗體結(jié)合活性。

 

使用不同濃度的抗FGFR3 scFvs抗體(0.02-2umol/L)處理RT-112細(xì)胞，48小時(shí)后，使用MTT對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后570nm讀數(shù)。細(xì)胞活力通過下面公式計(jì)算：Abs-scFv處理的細(xì)胞/Abs-對(duì)照組細(xì)胞。

 

篩選FGFR3特異性scFv抗體：如表1所示，總共隨機(jī)挑選了288個(gè)克隆，通過ELISA檢測(cè)，獲得15個(gè)FGFR3特異性的抗體克隆。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，15個(gè)克隆里面有6個(gè)克隆的序列是唯一的。3A和1D序列內(nèi)部有一個(gè)終止密碼子，只在VL的CDR2區(qū)有一個(gè)堿基突變。其他4個(gè)克隆的序列有比較大的區(qū)別，主要區(qū)別集中在CDR2和CDR3。其中CDR3在VH和VL都是高度可變的，CDR2的突變主要集中在VH。

 

ELISA特異性鑒定發(fā)現(xiàn)：如圖2所示，盡管FGFR1和FGFR3具有高度同源性(>62%)，6個(gè)篩選到的scFv克隆都對(duì)FGFR3具有顯著的結(jié)合特異性；相反和FGFR1的結(jié)合活性非常弱，和陰性對(duì)照人IgG的反應(yīng)結(jié)果類似。

圖2：ELISA檢測(cè)篩選到的可溶性scFvs結(jié)合特異性。從培養(yǎng)上清中獲得的scFv-pIII融合蛋白，通過ELISA方法檢測(cè)和FGFR3-Fc(黑色)，F(xiàn)GFR1-Fc(灰色)以及陰性對(duì)照人IgG(白色)的結(jié)合活性。

 

使用Biacore分析了純化后單體scFv抗體和FGFR3的親和力。如表2所示，檢測(cè)了不同scFvs的Kon，Koff以及Kd值。Kd值在40.9和12.4nmol/L之間變化，表明篩選到的scFv具有中等到較高的親和活性。如果考慮了使用的噬菌體的庫(kù)容只有1.6*108，屬于中等大小庫(kù)容，這個(gè)結(jié)果已經(jīng)非常好了。

 

scFv抗體對(duì)RT112細(xì)胞表達(dá)的FGFR3的活性：使用FACS檢測(cè)了scFvs和膀胱癌RT112細(xì)胞表達(dá)的天然FGFR3蛋白的結(jié)合活性。如圖3A所以，首先檢測(cè)了6個(gè)scFvs噬菌體克隆，6個(gè)克隆都可以和膀胱癌RT112細(xì)胞發(fā)生顯著的反應(yīng)。然后，檢測(cè)純化后的4個(gè)scFvs蛋白(3B，3C，2D，7D)的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)3C和7D可以和RT112細(xì)胞發(fā)生顯著的反應(yīng)，2D和3B的反應(yīng)活性相對(duì)較弱。使用共聚焦顯微鏡觀察了3C和7D染色的細(xì)胞，進(jìn)一步顯示出scFv的膜蛋白染色特征(圖3A)。

通過在非變性條件下的免疫沉淀方法進(jìn)一步證明scFv和FGFR3的親和特異性。如圖3B所示，純化后的兩個(gè)scFv（3C和7D）都在正確的位置產(chǎn)生顯著的蛋白條件，進(jìn)一步證明這兩個(gè)scFv抗體可以識(shí)別可溶性的和天然的FGFR3受體。

 

scFv抗體和FGFR3突變體的反應(yīng)活性：因?yàn)镕GFR3在膀胱癌細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生突變，所以，也檢測(cè)了兩個(gè)scFv抗體和FGFR3 S249C突變體的結(jié)合活性，已有報(bào)道FGFR3 S249C是在膀胱癌細(xì)胞中最經(jīng)常發(fā)生的突變形式。通過PCR方法在FGFR3中引入上面的突變，并通過DNA測(cè)序證明突變位點(diǎn)正確(如圖4A)。通過western bolt驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞可以正確表達(dá)突變的FGFR3S249C蛋白(如圖4B)，并且FGFR3S249C具有和野生型FGFR3WT相類似的表達(dá)水平。FACS分析證明兩個(gè)scFvs 3C和7D都可以識(shí)別表達(dá)了突變FGFR3蛋白的HEK293T細(xì)胞，甚至比表達(dá)野生型FGFR3蛋白的細(xì)胞的反應(yīng)活性更強(qiáng)(圖4C)。

 

抑制RT112細(xì)胞增殖：我們檢測(cè)了scFvs在體外抑制RT112腫瘤細(xì)胞增殖的有效性。加入三個(gè)不同濃度的scFv到RT112細(xì)胞，如圖5A所示，兩個(gè)scFv 3C和7D都能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，而且抑制效應(yīng)和加入的抗體濃度成正相關(guān)。2umol/L濃度的時(shí)候，抑制活性最強(qiáng)，但是在0.2umol/L的時(shí)候，仍然具有顯著的抑制活性。

除此之外，檢測(cè)了不同的生長(zhǎng)因子對(duì)scFvs抑制效應(yīng)的影響。如圖5B所示，scFvs的抑制效應(yīng)具有蛋白因子特異性。3C和7D都可以抑制由FGF9誘導(dǎo)的增殖，但是，只有7D能夠抑制FGF1誘導(dǎo)的增殖。兩個(gè)scFvs抗體都不能抑制EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，此外，加入可溶性的FGFR3蛋白，可以掩蓋掉scFv的抑制效果。從形態(tài)學(xué)上看，3C和7D處理后，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，尤其是7D處理后能明顯導(dǎo)致細(xì)胞空泡形成(圖5C)。

 

圖3.FACS和共聚焦顯微鏡分析噬菌體、可溶性scFvs蛋白和RT112膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合活性。A. FACS 直方圖顯示每個(gè)scFv克隆的結(jié)合活性(粗線)以及背景熒光(灰色)。RT112細(xì)胞使用3C 和7D scFvs標(biāo)記，使用FITC熒光抗體以及DAPI染色細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡下成像顯示(綠色)scFvs蛋白結(jié)合細(xì)胞膜，(紅色)DAPI染色細(xì)胞核區(qū)域。B. RT112細(xì)胞裂解液FGFR3 IP分析。A.RT112細(xì)胞裂解液；B. 陰性對(duì)照；C, scFv3C；D, scFv7D。

 

圖4.篩選到的scFvs和FGFR3突變體胞外區(qū)域的反應(yīng)活性。A.測(cè)序顯示DNA序列中引入突變：Ser(TCC)249 突變?yōu)镃ys (TGC)。B. 免疫印跡分析證明野生型FGFR3和突變FGFR3 (S249C) 在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)。C . F A C S 分析s c F v 蛋白和表達(dá)野生型FGFR3及突變FGFR3 (S249C) HEK293T細(xì)胞的結(jié)合活性。柱狀圖中：灰色表示陰性對(duì)照；黑色線表示FGFR3(IIIc)WT ；虛線表示FGFR3(IIIc)S249C。

 

圖5. FGFR3特異性的scfvs抗體對(duì)RT112細(xì)胞增殖的抑制。A. 不同濃度的3B, 3C, 2D和7D scFvs抗體對(duì)RT112細(xì)胞的抑制活性。C. 2 umol/L 3C and 7DscFvs處理細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的分析。

 

FGFR3是一個(gè)受體酪氨酸激酶，通過激活不同的信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。除了膀胱癌，F(xiàn)GFR3在許多類型腫瘤中發(fā)生突變和過表達(dá)，所以FGFR3能作為一個(gè)優(yōu)秀的有效的治療的腫瘤靶點(diǎn)。以前的研究表明，可溶性的天然FGFR3的胞外配體結(jié)合區(qū)域具有抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，原理就是可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體，減少配體和細(xì)胞表面受體結(jié)合�？贵w片段可能模仿類似的機(jī)制來抑制細(xì)胞增殖，事實(shí)上，許多研究已經(jīng)表明，3C和7D能夠抑制RT112細(xì)胞增殖的機(jī)理就是抗體片段直接阻止了FGF-FGFR3的相互作用，從而抑制了FGFR3的激活。但是3C和7D結(jié)合FGFR3后的解離速度太快(即Koff值太高約

1.22*10-2和6.14*10-2)，Koff的減少，意味著Kd值的增加，即抗體親和力增加。所以，可以以3C和7D scFv的序列為模板，在此基礎(chǔ)上通過CDR區(qū)突變或者體細(xì)胞突變模仿來進(jìn)行親和力成熟。

 

1. Jorge Martínez-Torrecuadrada, Gabriela Cifuentes, Paula López-Serra, et al., Targeting the Extracellular Domain of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 with Human Single-Chain Fv Antibodies Inhibits Bladder Carcinoma Cell Line Proliferation. Clin Cancer Res 2005;11:6280-6290.