RNA實(shí)驗(yàn)和方案新手必讀（二）

瀏覽次數(shù)：6271　發(fā)布日期：2015-3-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

RNA操作常見注意事項(xiàng)

核糖核酸酶（RNase）是非常穩(wěn)定、活躍的酶，它們通常不需要輔因子就能發(fā)揮功能。由于核糖核酸酶難以失活，并且很小的量就足以破壞RNA分子，因此在沒有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情況下，不要使用任何塑料或者玻璃器皿。處理RNA時(shí)應(yīng)非常小心，以避免在純化的過程中或者純化之后，將核糖核酸酶無意的引入到RNA樣品中。為了創(chuàng)造并維持沒有核糖核酸酶的環(huán)境，在預(yù)處理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液處理RNA時(shí)，一定要采取以下預(yù)防措施。

常規(guī)操作

處理RNA時(shí)，一定要使用合適的微生物學(xué)的無菌技術(shù)。手和灰塵顆�？赡軙�(huì)攜帶細(xì)菌和霉菌，是最常見的核糖核酸酶污染源。為了阻止來源于皮膚表面或者實(shí)驗(yàn)室器械灰塵上的核糖核酸酶污染，在操縱試劑以及RNA樣品的時(shí)候，一直要佩戴乳膠手套或者乙烯基手套（PVC手套）�？赡艿那闆r下，要經(jīng)常更換手套，并將試管處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)用移液管吸取溶液用于下游應(yīng)用時(shí)，要將純化過的RNA放在冰上。

為了去除工作臺(tái)表面、非一次性塑料器皿和實(shí)驗(yàn)室器械（比如，移液管和電泳槽）上的核糖核酸酶污染，推薦使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常見的實(shí)驗(yàn)室試劑去除核糖核酸酶的污染。為了去除塑料器皿上的污染，使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗滌，然后使用去RNase的水洗滌；如果塑料器皿具有耐氯仿性，則可用氯仿洗滌。為了去除電泳槽的污染，可使用去污劑清潔（比如，0.5%的SDS），使用去RNase的水洗滌，然后用乙醇洗滌（如果電泳槽具有耐乙醇性），之后晾干。

重要：在使用化學(xué)試劑時(shí)，一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服，一次性的手套，以及具有護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。

一次性塑料耗材

在處理RNA的時(shí)候，推薦使用無菌的，一次性的聚丙烯管。這些試管通常沒有核糖核酸酶，因此不需要預(yù)處理使核糖核酸酶失活。

非一次性的塑料耗材

非一次性的塑料耗材在使用之前應(yīng)該進(jìn)行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材應(yīng)該嚴(yán)格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗滌，然后用去RNase的水洗滌。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗滌，以使核糖核酸酶失活。

玻璃器皿

玻璃器皿在使用之前，應(yīng)該進(jìn)行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。用于處理RNA的玻璃器皿在使用之前，應(yīng)該使用去污劑清潔，嚴(yán)格的洗滌，并在240°C的烘箱中烘烤至少4小時(shí)（如果更方便的話，可以過夜）。也可以使用DEPC（焦碳酸二乙酯）處理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC（0.1%的水溶液）充滿玻璃器皿，在37°C的條件下過夜（12小時(shí)），然后使用高壓釜處理或者加熱到100°C 15分鐘，以去除剩余的DEPC。

重要：在使用化學(xué)試劑時(shí)，一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服，一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。

電泳槽

電泳槽應(yīng)使用去污劑（比如，0.5%的SDS）清潔，嚴(yán)格的用去RNase的水洗滌，然后使用乙醇洗滌，之后晾干。

重要：在使用化學(xué)試劑時(shí)，一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服，一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商處提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。

重要：一些電泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性，需要仔細(xì)查閱廠商說明書。

溶液

溶液（水或者其它溶液）應(yīng)該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強(qiáng)大但非絕對(duì)的RNase抑制劑，它通過共價(jià)修飾RNase發(fā)揮作用。

重要：在使用化學(xué)試劑時(shí)，一定要穿戴合適的實(shí)驗(yàn)工作服，一次性的手套以及護(hù)目鏡。請(qǐng)參考產(chǎn)品廠商提供的相應(yīng)安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。

不含RNase的溶液的制備

溶液（水或者其它溶液）應(yīng)該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強(qiáng)大但非絕對(duì)的RNase抑制劑。濃度為0.1%的DEPC經(jīng)常用于處理玻璃或者塑料耗材，以使其表面的RNase失活，或者制備不含RNase的的溶液和水。DEPC通過共價(jià)修飾使RNase失活。在100 ml要處理的溶液中加入0.1 ml DEPC，大力的搖晃，以使DEPC充分進(jìn)入溶液。將溶液在37°C的條件下孵育12個(gè)小時(shí)。在高壓滅菌器內(nèi)處理15 min以去除任何DEPC的痕跡。DEPC與伯胺發(fā)生反應(yīng)，因此不能直接用于處理Tris緩沖液。在Tris緩沖液存在的條件下，DEPC非常不穩(wěn)定，迅速分解為乙醇和CO2。在制備Tris緩沖液時(shí)，應(yīng)先使用DEPC處理水，然后將Tris溶解以制備合適的緩沖液。痕量的DEPC會(huì)通過乙�；饔�，與RNA分子中的嘌呤殘基反應(yīng)，將其修飾。在細(xì)胞外的環(huán)境中，乙�；腞NA分子以很低的效率被翻譯。但是，除非有大量的嘌呤殘基被修飾了，否則不會(huì)嚴(yán)重的影響這些RNA分子雜交形成DNA：RNA或者RNA：RNA雜交物的能力。溶液或者器皿上殘留的DEPC，一定要在高壓滅菌器中處理或者加熱到100°C處理15 min，以便除去。

生物樣本中RNA的穩(wěn)定處理

為了確�；虮磉_(dá)分析的精確性，所分析的RNA應(yīng)能夠準(zhǔn)確地反映出其在生物樣本中的體內(nèi)表達(dá)情況。但實(shí)際在樣本的操作和RNA的分離過程中，RNA很容易發(fā)生改變而使情況變得復(fù)雜。

生物樣本一經(jīng)提取，其中的RNA即變得極不穩(wěn)定。期間所發(fā)生的人為影響主要分成兩種�；虻南抡{(diào)和RNA的酶促降解會(huì)導(dǎo)致mRNA特異性或非特異地發(fā)生人為降低。同時(shí)在操作和加工樣本的過程中，某些基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。這兩種效應(yīng)的綜合可能在檢出的轉(zhuǎn)錄譜與體內(nèi)真實(shí)情況之間造成偏差。

對(duì)RNA表達(dá)譜進(jìn)行即刻的穩(wěn)定化處理是精確基因表達(dá)分析中的首要事項(xiàng)。通常情況下，用于RNA分析的樣本被迅速置于液氮中冷凍，在進(jìn)一步處理之前一直儲(chǔ)存于–80°C下。產(chǎn)品供應(yīng)商也提供了一些穩(wěn)定處理試劑，作為替代方法對(duì)生物樣本中的RNA進(jìn)行穩(wěn)定化處理。這些供應(yīng)商提供了集成化的樣本處理溶液（套裝），其中包括容器，穩(wěn)定處理試劑及制備試劑盒

RNA的大小和分子量

不同RNA的大小和分子量 RNA	核苷酸	分子量（道爾頓）
E. coli tRNA 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA	75 120 1541 2904	2.6 x 104 4.1 x 104 5.2 x 105 9.9 x 105
果蠅 18S rRNA 28S rRNA	1976 3898	6.7 x 105 1.3 x 106
小鼠 18S rRNA 28S rRNA	1869 4712	6.4 x 105 1.6 x 106
兔子 18S rRNA 28S rRNA	2366 6333	8.0 x 105 2.2 x 106
人 18S rRNA 28S rRNA	1868 5025	6.4 x 105 1.7 x 106