microRNA的實(shí)時(shí)定量莖環(huán)RT-PCR技術(shù)

        

已開發(fā)出一種新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄，Taqman PCR分析。莖環(huán)RT引物在RT 效率和特異性方面比傳統(tǒng)的更好。TaqMan miRNA的檢測(cè)是很具體的，可以檢測(cè)成熟miRNA和區(qū)分相關(guān)的甚至低至一個(gè)核苷酸的miRNAs。此外，他們不會(huì)受到基因組DNA污染的影響。精確量化可以從低至25皮克的總RNA中提取大多數(shù)miRNA。

 

事實(shí)上，這種方法靈敏度高，特異性強(qiáng)和精密度高，允許無(wú)需核酸純化，直接分析單個(gè)細(xì)胞。

 

如標(biāo)準(zhǔn)TaqMan基因表達(dá)分析，TaqMan miRNA的檢測(cè)顯示出了7個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。七個(gè)小鼠組織中五個(gè)miRNA定量顯示，在每個(gè)細(xì)胞中，有低至10到超過(guò)30000個(gè)拷貝數(shù)。這種方法可以確保快速，準(zhǔn)確，靈敏miRNA表達(dá)譜，并能識(shí)別和監(jiān)控特定組織或疾病的潛在生物標(biāo)志物。莖環(huán)RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干擾RNA（siRNAs）的量化。此外，為更好的特異性和效率，莖環(huán)RT引物設(shè)計(jì)的概念可以應(yīng)用在小分子RNA克隆和多重檢測(cè)。

 

 

miRNA是自然發(fā)生的，高度保守的轉(zhuǎn)錄家庭，來(lái)源于較大的發(fā)夾前體。miRNA是在動(dòng)物和植物的基因組上發(fā)現(xiàn)的。到目前為止，有1000個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中，在桑格中心miRNA的注冊(cè)表中包括326人類miRNA。

 

miRNA是通過(guò)催化mRNA的分裂或抑制mRNA的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。他們被認(rèn)為在細(xì)胞發(fā)育，分化和傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。具體職責(zé)包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和新陳代謝，發(fā)育時(shí)間，細(xì)胞死亡，造血，神經(jīng)發(fā)育，人類腫瘤形成與DNA甲基化和染色質(zhì)修飾。

 

雖然miRNA的相對(duì)豐富的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物類別，其表達(dá)水平在物種和組織之間相差很大。低豐度的miRNA經(jīng)常逃避檢測(cè)技術(shù)，如克隆，Northern雜交和基因芯片分析。這里，我們提出一種新型實(shí)時(shí)定量方法，能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)miRNA與其他小分子RNA。這種方法擴(kuò)展了實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，從大分子的基因表達(dá)到微分子的變化檢測(cè)。

 

從桑格中心的miRNA注冊(cè)網(wǎng)站 中篩選目標(biāo)，引物和探針。所有TaqMan miRNA檢測(cè)，可通過(guò)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（P / N4365409）得到。miRNA標(biāo)準(zhǔn)TaqMan分析，采用PrimerExpress軟件設(shè)計(jì)PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前體miR-30A。所有序列在補(bǔ)充資料部分可用。合成miRNA的寡核苷酸從Integrated DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)購(gòu)買。

 

從Ambion公司（P / N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826和7968）購(gòu)買10-12天老鼠的腦，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的總RNA樣品。 Ambion公司鼠的總RNA來(lái)自瑞士韋伯斯特小鼠�；�于TaqMan基因表達(dá)分析人類或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）內(nèi)對(duì)照（P / N4310884E4352339E，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）所有的RNA樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

 

兩個(gè)細(xì)胞株HepG2和OP9，培養(yǎng)，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad, CA）補(bǔ)充10％胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan, UT)培養(yǎng)。用血球計(jì)對(duì)胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。約2.8×106個(gè)懸浮細(xì)胞通過(guò)離心沉淀，1500r.p.m.離心5分鐘，用1毫升不添加 MgCl2 and CaCl2的杜爾貝科的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。

 

細(xì)胞再懸浮于140毫升PBS，并用三種不同的樣品制備方法處理。第一種方法，一個(gè)50毫升的樣本（10⁶個(gè)細(xì)胞）等量的核酸純化裂解液混合，用吸管反復(fù)吹打十次，然后旋轉(zhuǎn)。在添加到RT反應(yīng)體系前，將裂解液用1 U / ml的RNase抑制劑溶液稀釋1/10。在第二種方法中，用mirVanamiRNA提取試劑盒提取50毫升的樣本（10⁶個(gè)細(xì)胞）。純化的總RNA在100毫升洗脫緩沖液中洗脫。第三種方法用1×PBS稀釋1/2，95℃加熱5分鐘，在加入RT反應(yīng)體系前立即在冰上保存。

 

根據(jù)制造商的協(xié)議，使用mirVana-miRNA的檢測(cè)試劑盒對(duì)miRNA雜交分析。由IDT合成RNA探針。放射性同位素標(biāo)記的RNA片段用氣旋存儲(chǔ)熒光粉系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)和定量。

 

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中包含的RNA樣品，包括純化總RNA，細(xì)胞裂解物，和熱處理細(xì)胞，50納米的莖環(huán)RT引物，1×RT緩沖液，每dNTPs濃度0.25毫米，3.33 U / µL 的逆轉(zhuǎn)錄酶和0.25 U / µL的RNase抑制劑。7.5微升反應(yīng)體系在9700溫度循環(huán)器96- 或 384-平板上16℃培養(yǎng)30分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘，然后保持4℃。所有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，包括無(wú)模板對(duì)照和RT負(fù)對(duì)照，都進(jìn)行一次重復(fù)。

 

采用標(biāo)準(zhǔn)的TaqManPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。 10μLPCR反應(yīng)體系包括0.67μLRT產(chǎn)物，1×TaqMan Mix ，0.2μM的TaqMan探針，1.5m M正向引物和0.7µM反向引物。反應(yīng)在 384-平臺(tái)上95℃培養(yǎng)10分鐘，95℃15秒60℃1分鐘40個(gè)循環(huán)。所有的反應(yīng)一式三份。 C _T為在熒光通過(guò)固定閾值的循環(huán)數(shù)。熒光定量CT值轉(zhuǎn)換成絕對(duì)數(shù)量的拷貝數(shù)，使用合成林-4 miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

我們提出了一個(gè)新的miRNA的定量的實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)方案。它包括兩個(gè)步驟：RT和實(shí)時(shí)PCR。首先，莖環(huán)RT引物是與miRNA分子雜交，然后用Multi-Scribe反轉(zhuǎn)錄。接下來(lái)，用傳統(tǒng)的TaqMan PCR，對(duì)RT產(chǎn)品進(jìn)行定量。

 

 

圖1。上圖描述的是TaqMan miRNA的檢測(cè)原理，基于TaqMan實(shí)時(shí)定量miRNA的包括兩個(gè)步驟，莖環(huán)RT和實(shí)時(shí)PCR。莖環(huán)RT引物結(jié)合在miRNA分子的3'端和用反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄。然后，RT產(chǎn)品使用傳統(tǒng)的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和染料標(biāo)記的TaqMan探針。尾正向引物5'的作用是根據(jù)miRNA分子的序列組成增加其熔融溫度（Tm）。

 

 

 

圖2。TaqMan-4 miRNA的檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度。 （A）4超過(guò)7個(gè)數(shù)量級(jí)的 lin-4 miRNA擴(kuò)增曲線。合成的RNA輸入范圍從1.3×10^－3 fM（相當(dāng)于每次反應(yīng)7個(gè)拷貝數(shù)） 〜1.3×10⁴ FM（相當(dāng)于每次反應(yīng)7×10⁷拷貝數(shù)）；（B）lin-4 miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

miRNA定量的動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度的計(jì)劃使用一種人工合成的CEL-LIN-4靶進(jìn)行首次評(píng)估。合成的RNA在 A₂₆值的基礎(chǔ)上量化，稀釋超過(guò)7個(gè)數(shù)量級(jí)。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA的檢測(cè)結(jié)果顯示在目標(biāo)輸入和CT值之間有極好的線性關(guān)系，表明，該檢測(cè)有至少7個(gè)動(dòng)態(tài)范圍，并能夠檢測(cè)PCR反應(yīng)中少于7個(gè)的拷貝數(shù)（圖2）。

 

采用小鼠肺總RNA的八個(gè)額外miRNA的檢測(cè)也被證實(shí)。RNA的輸入范圍從0.025到250納克（圖3）。 相關(guān)的RNA輸入的TheC_T 值超過(guò)4個(gè)數(shù)量級(jí)（R2>0.994）。陰性對(duì)照檢測(cè)中，即使在250納克總RNA鼠標(biāo)的反應(yīng)中，CEL-MIR-2沒(méi)有給出一個(gè)檢測(cè)信號(hào)。

 

根據(jù)七個(gè)不同的鼠組織中五個(gè)miRNA的表達(dá)譜測(cè)定，創(chuàng)建一個(gè)miRNA的表達(dá)圖譜。每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)根據(jù)輸入的總RNA（假設(shè)15皮克/細(xì)胞）和合成lin-4目標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。從這個(gè)表達(dá)圖譜上作了一些有趣的觀察。首先，miRNA非常豐富，組織中每個(gè)細(xì)胞平均有2390個(gè)拷貝數(shù)。每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的拷貝數(shù)在10-32090之間變化。在所有組織中，12個(gè)miRNA里，miR-16和miR-323是最豐富和最低量表達(dá)的miRNA。此外，每個(gè)組織都有獨(dú)特的miRNA的表達(dá)水平。miRNA表達(dá)的整體水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在7個(gè)組織中，miRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)范圍變化很大，從不到5倍(let-7a)到超過(guò)2000倍(miR-323) （表1）。

 

評(píng)估RNA分離的需要，我們直接在miRNA的檢測(cè)中增加了細(xì)胞裂解物。相當(dāng)于直接在7.5毫升逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加2.5-2500細(xì)胞。當(dāng)檢測(cè)到，在一些細(xì)胞中CT值相關(guān)R2>0.998）的RT反應(yīng)至少有三個(gè)數(shù)量級(jí)（圖4）。

 

圖3�？俁NA輸入的閾值循環(huán)（CT）值檢測(cè)8個(gè)miRNA的相關(guān)性。每RT反應(yīng)中，小鼠肺總RNA輸入范圍從0.025到250納克。將新桿狀線蟲的miRNA（MIR-2）列入作為陰性對(duì)照。

 

 

鼠或人的腦，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的總RNA樣品均購(gòu)自Ambion公司。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線lin-4合成的miRNA對(duì)每個(gè)細(xì)胞拷貝數(shù)進(jìn)行估計(jì)。每個(gè)RT反應(yīng)中添加150ng的RNA（或相當(dāng)于約10 000個(gè)細(xì)胞，假設(shè)每個(gè)細(xì)胞中有15pg總RNA）。依據(jù)TaqMan磷酸甘油醛脫氫酶的內(nèi)對(duì)照（P / N4352339E）將RNA規(guī)范化輸入。

 

檢測(cè)了12組非特定的基因組DNA對(duì)TaqMan miRNA的影響。結(jié)果表明，RT反應(yīng)中是否添加5納克人類基因組DNA對(duì)CT值沒(méi)有影響，表明RNA的目標(biāo)（數(shù)據(jù)未顯示）檢測(cè)是非常特異的�；�于這一觀察，我們直接miRNA定量檢測(cè)中增加了熱處理細(xì)胞。圖5顯示了使用純化總RNA，細(xì)胞裂解物，從同樣數(shù)目的HepG2細(xì)胞得到的熱處理細(xì)胞的miRNA進(jìn)行定量比較。直接添加熱處理細(xì)胞的miRNA的檢測(cè)CT值最低，和其他三種不同的樣品制備方法相似。

 

 

 圖4。使用OP9細(xì)胞裂解物檢測(cè)TaqMan miRNA的動(dòng)態(tài)范圍。 每個(gè)RT體系中輸入細(xì)胞數(shù)范圍為3至2500個(gè)細(xì)胞。采用新桿狀線蟲elegans miRNA（MIR-2）作為陰性對(duì)照。

 

 

 圖5。對(duì)熱處理細(xì)胞，細(xì)胞裂解液和10 miRNA實(shí)時(shí)定量總RNA進(jìn)行比較。用閾值循環(huán)（CT）來(lái)衡量miRNA的表達(dá)水平。每PCR擴(kuò)增約400 HepG2細(xì)胞進(jìn)行了分析。

 

 

 圖6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比較來(lái)解決以印跡雜交為基礎(chǔ)的分析�？俁NA來(lái)自小鼠腎，肝，肺，脾和睪丸組織。

 

由兩個(gè)獨(dú)立運(yùn)行系統(tǒng)（數(shù)據(jù)未顯示）對(duì)12 miRNA16重復(fù)檢測(cè)TaqMan miRNA的可再現(xiàn)性。CT的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為0.1，顯示檢測(cè)的高精度。

 

我們采用一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)，這個(gè)技術(shù)是基于雜交印跡的miRNA分析，比較TaqMan miRNA的檢測(cè)（圖6）。我們觀察到雜交為基礎(chǔ)的miRNA分析重復(fù)性差，在從目標(biāo)到目標(biāo)的變化中和TaqMan分析一致。五個(gè)鼠組織樣本中的miR-16的兩種方法（R2= 0.916）一致。然而，在低豐度的miRNA中相關(guān)性相對(duì)較低，如miR-30的（R2= 0.751）。

 

雜交的方法對(duì)成熟的miRNA來(lái)講缺乏特異性。我們調(diào)查了TaqMan miRNA區(qū)分成熟miRNA和較長(zhǎng)的前體的檢測(cè)能力，合成pri-miRNA前體，pri-miR-26b和pri-let-7a和pre-miRNA 前體pre-miR-30a（見表2）。 TaqMan分析旨在檢測(cè)前體和成熟的miRNA進(jìn)行合成平均1.5的目標(biāo)×108％RT反應(yīng)副本（每PCR體系1.3×10⁷拷貝數(shù)）。僅PRI-miRNA前體分子的TaqMan miRNA的分析產(chǎn)生了較成熟的miRNA的分析高出至少11個(gè)循環(huán)的CT值。這一結(jié)果意味著，如果成熟的miRNA和前體在濃度相同，后者將在檢測(cè)成熟的目標(biāo)時(shí)貢獻(xiàn)<0.05％的背景信號(hào)。對(duì)于pre-miR-30a來(lái)講，成熟的miRNA miR-30a-3p定位于在pre-miR-30a序列3’末端，觀察到8.4 C_T的差異。結(jié)果表明，對(duì)于成熟miRNA來(lái)說(shuō)，TaqMan miRNA的檢測(cè)是特異的。然而，如果miRNA位于pre-miRNA前體鏈5'端，特異性分析更好�？俁NA實(shí)驗(yàn)分析代替合成目標(biāo)，表明，前體與成熟miRNA相比，至少豐富度小于兩個(gè)數(shù)量級(jí)，基于C^T 在miR-26b-1 和 let-7a-2前體的差異多于7個(gè)或7個(gè)以上數(shù)量級(jí)。一并考慮，這些結(jié)果表明，對(duì)于成熟miRNA來(lái)說(shuō)，TaqMan miRNA的檢測(cè)更加特異。

 

 

 圖7。let-7 miRNA的檢測(cè)鑒別力。相對(duì)檢測(cè)（％）計(jì)算是基于C_T完全匹配和不匹配的目標(biāo)之間的差異。在RT反應(yīng)中添加合成RNA的1.5×10⁸ 拷貝數(shù)。估計(jì)濃度在A₂₆₀ 值的基礎(chǔ)上。

 

TaqMan miRNA的檢測(cè)能力不同，是依據(jù)采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5個(gè)合成miRNA來(lái)檢測(cè)低至一個(gè)核苷酸（圖7）。每個(gè)miRNA的檢測(cè)對(duì)應(yīng)每個(gè)miRNA。相對(duì)探測(cè)效率是通過(guò)計(jì)完全匹配和不匹配的目標(biāo)CT之間的差異，假設(shè)完美匹配的效率為100％。觀察非特異性信號(hào)處在非常低的水平，從零到0.3％，對(duì)于miRNA有2-3不匹配，0.1-3.7％的單核苷酸不同。許多交叉反應(yīng)，是由RT反應(yīng)反應(yīng)中G-T的錯(cuò)配導(dǎo)致的。如果miRNA之間出現(xiàn)超過(guò)三個(gè)不匹配，會(huì)有針對(duì)性的miRNA檢測(cè)。

 

我們比較歧視的TaqMan miRNA的檢測(cè)能力的不同，以解決雜交分析為基礎(chǔ)的檢測(cè)（圖8）。在我們的手中，雜交方法可以很好地區(qū)分let-7a和let-7b。然而，在let-7a, let-7c 和 let-7d之間，幾乎沒(méi)有區(qū)別，而是由1–3 nt區(qū)分。

 

我們推測(cè)，莖環(huán)引物可能會(huì)比線性引物提供更好的RT效率和特異性。依據(jù)莖環(huán)的堆放可能加強(qiáng)RNA-DNA的熱穩(wěn)定性。此外，與傳統(tǒng)的線性RT引物，莖環(huán)的空間約束可能會(huì)提高檢測(cè)的特異性。我們比較的莖環(huán)和線性RT引物合成miRNA let-7a的靈敏度和特異性(圖 9)。我們觀察到了莖環(huán)RT幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。首先，在合成let-7A目標(biāo)時(shí)，線性和莖環(huán)RT方法CT值有7個(gè)數(shù)量級(jí)不同，表明莖環(huán)RT的效率高出至少100倍。其次，莖環(huán)RT在區(qū)分miRNA之間不同時(shí)，是基于ΔCT值兩個(gè)原則的不同。最后，依據(jù)7個(gè)數(shù)量級(jí)ΔC_T，對(duì)于區(qū)分成熟的miRNA和其前體，莖環(huán)RT至少好100倍。

 

由于miRNA的發(fā)現(xiàn)，這些基因家族的特征的顯著進(jìn)展已經(jīng)描繪了基因調(diào)控中miRNA功能的機(jī)制。因此，識(shí)別miRNA的生物標(biāo)記特定的組織類型或疾病狀態(tài)的廣泛的研究已經(jīng)開始。這些研究將會(huì)受益于miRNA準(zhǔn)確識(shí)別和量化方法。

 

當(dāng)前檢測(cè)和量化miR-NAs的方法主要基于克隆，Northern雜交，或引物延伸。盡管芯片可以提高miRNA譜的產(chǎn)量，該方法在靈敏度和特異性方面有著是相對(duì)的局限性。對(duì)于miRNA的定量，靈敏度低已成為一個(gè)的問(wèn)題，因?yàn)楹茈y放大這些短的RNA目標(biāo)片段。此外，特異性低，可能會(huì)導(dǎo)致密切相關(guān)的miRNA、前體和基因組序列的錯(cuò)誤的積極信號(hào)。最近，已報(bào)道了針對(duì)miRNA量化的修改后的侵襲物檢測(cè)。然而，侵襲物檢測(cè)特異性和敏感性有限，每檢測(cè)至少需要50 ng總RNA，或1000裂解細(xì)胞。

 

實(shí)時(shí)PCR是基因表達(dá)的定量的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于科學(xué)家來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)常規(guī)PCR，檢測(cè)平均22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA，一直是一種長(zhǎng)期挑戰(zhàn)來(lái)。我們開發(fā)了一種新的機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)TaqManPCR反應(yīng)檢測(cè)，用超過(guò)現(xiàn)有的常規(guī)檢測(cè)方法的優(yōu)越的性能來(lái)特異量化miRNA的表達(dá)水平。我們?cè)O(shè)計(jì)和驗(yàn)證檢測(cè)了222個(gè)人的miRNA。這些分析相結(jié)合了PCR技術(shù)精湛的靈敏度，實(shí)時(shí)監(jiān)控動(dòng)態(tài)范圍和TaqMan方法報(bào)道，以增加特異性。在我們的手中，與成熟miRNA相比，miRNA前體的效果至少差2000倍。由于對(duì)于前體或基因組DNA這些檢測(cè)是不敏感的，我們可以直接添加熱處理細(xì)胞檢測(cè)，消除了樣品制備的需要。對(duì)于成熟的miRNA及其前體的檢測(cè)的需要，可用傳統(tǒng)的TaqMan分析法來(lái)特異地檢測(cè)前體。

 

我們觀察到由于堿基堆積和空間約束的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)RT引物比傳統(tǒng)的線性引物有更好的特異性和敏感性（圖9）。堿基堆積性可以提高熱穩(wěn)定性，并延長(zhǎng)有效的RT引物/ RNA雙螺旋，可能需要相對(duì)較短的逆轉(zhuǎn)錄引物來(lái)提高RT的有效性。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的空間限制，可以防止結(jié)合基因組雙鏈DNA。因此，RNA樣品制備為消除TaqMan miRNA的需要。潛在的莖環(huán)RT引物可以為多重RT反應(yīng)和小分子RNA克隆可能提供更好的效率和特異性。

 

對(duì)于整體miRNA譜有一個(gè)敏感的、特異地增加需求。有效高調(diào)的miRNA的能力可能會(huì)導(dǎo)致miRNA的生物標(biāo)志物疾病或組織特異性的發(fā)現(xiàn)，以及有助于理解miRNA如何調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化。我們的莖環(huán)RT-PCR方法，可以為這些研究提供了一個(gè)切實(shí)可行的解決辦法。我們目前正在開發(fā)多重辦法，要進(jìn)一步提高這種方法的效用。