Western印跡法（試劑配制和操作步驟）
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）
這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應。這種技術(shù)的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。
儀器：高壓鍋、電動勻漿機、高速離心機、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、脫色搖床。
試劑：單去污劑裂解液、分離膠、4％濃縮loading、G250考馬斯亮藍溶液、5XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、顯影液、定影液、抗體、ECL化學發(fā)光試劑。
雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纖維素膜，乳膠手套，口罩，保鮮膜，X-光片夾，X-光片，計時器，吸水紙。
試劑配制：
（一）母液
34.8mg/ml (200mmol/L)PMSF
PMSF 0.348g
異丙醇 10ml
溶解后，－20℃保存。
10％SDS
SDS 5g
蒸餾水至 50ml
50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
5mol/LNaF氟化鈉
氟化鈉 2.1g
超純水 10ml
溶解后，-20℃保存。
100mmol/L 激活礬酸鈉
偏礬酸鈉 0.122g
超純水 8ml
加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至10（顏色變黃），80℃左右熱水浴至溶液無色，室溫冷卻，重調(diào)pH至10，重復熱水浴和調(diào)整pH的操作至溶液保持無色，定容10ml，-20℃保存。
1.0mol/L Tris•HCl（pH8.0）
Tris (MW121.14) 1.212g
超純水 8ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.0，最后用超純水定容至10ml，高溫滅菌后室溫下保存。
10％過硫酸胺（AP）
過硫酸胺 0.1g
超純水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存時間為2周。
1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超純水 200ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 0.606g
超純水 8ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至10ml，高溫滅菌后室溫下保存。
30％Acr/Bic（29：1）
丙稀酰胺（Acr） 14.5g
甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 0.5g
超純水至 50ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。
20％Tween20
Tween20 10ml
蒸餾水至 50ml
Tween20比較粘稠，需將大槍頭前端剪掉，將吸口擴大，吸取和移液時應緩慢，避免液體掛壁，混勻后4℃保存。
（二）使用液
單去污劑裂解液（50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％SDS，1mmol/L PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）2.5ml
NaCl 0.438g
10%SDS 0.5ml
200mmol/L PMSF 2.5ml
蒸餾水至 50ml
若檢測磷酸化蛋白，需加入100ul 5mol/L NaF和500ul 100mmol/L激活礬酸鈉，混勻后， 4℃保存。
G250考馬斯亮藍溶液（染膠專用）
考馬斯亮藍G250： 0.063g
甲醇： 15ml
乙酸： 5ml
蒸餾水至 50ml
溶解后，4℃保存。
分離膠（兩塊膠，10ml）
8％ 10% 12% 15%
超純水 4.6ml 4.0ml 3.3ml 2.3ml
30％Acr/Bic（29：1） 2.7ml 3.3ml 4.0ml 5.0ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml
10％SDS 100ml 100ml 100ml 100ml
10%AP（過硫酸胺） 100ml 100ml 100ml 100ml
TEMED 4ml 4ml 4ml 4ml
加 TEMED后，立即混勻即可灌膠。
4％濃縮膠（兩塊膠，5ml）
超純水 2.1ml
30％Acr/Bic（29：1） 0.5ml
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 0.38ml
10％SDS 30ml
10%AP（過硫酸胺） 30ml
TEMED 3ml
加 TEMED后，立即混勻即可灌膠。
還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris/HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚藍，50％甘油）
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 0.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.078g
SDS 0.1g
10%溴酚藍 0.05ml
甘油 0.5ml
混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。
電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 1.515g
甘氨酸（MW75.07） 9.385g
SDS 0.5g
蒸餾水至 500ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用2～3 次。
轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.01％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.1g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復使用2～3次。
10X麗春紅染液
麗春紅S 0.2g
三氯乙酸 3g
磺基水楊酸 3g
蒸餾水至 10ml
溶解后，避光4℃保存，使用時將其稀釋10倍，稀釋液勿回收。
TBS緩沖液（10mmol/L Tris/HCl pH7.5, 150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris•HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸餾水至 1000ml
TBST緩沖液（含 0.05％Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20 1ml
TBS 400ml
混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
封閉液（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）
脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌） 2.5g
TBST 50ml
溶解后4℃保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。
洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris•HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇) 700 ml （通風廚里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） 12.5ml
超純水至 100ml
配制時，在通風廚內(nèi)進行。 4℃保存。可重復使用1次。
ECL化學發(fā)光試劑
promage產(chǎn)品，分A和B兩種試劑，使用時等體積混合，每張膜使用混合液體積1ml。
