高速離心機(jī)技術(shù)在生物學(xué)上的應(yīng)用
離心技術(shù)在生物科學(xué)，特別是在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個(gè)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都要裝備多種型式的離心機(jī)。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度�！ �
一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時(shí)則以“g”表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報(bào)告超離心條件時(shí)，通常總是用地心引力的倍數(shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因?yàn)樗梢哉鎸?shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動(dòng)態(tài)變化。科技文獻(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值(RCFav)，即離心管中點(diǎn)的離心力。
為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole和Cotzias利用RCF的計(jì)算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對(duì)離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計(jì)算法方便(列線圖參見附錄)。換算時(shí)，先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺左邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值。
離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型
離心機(jī)可分為工業(yè)用離心機(jī)和實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)，制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為(用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè))，能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。
1.制備性離心機(jī)可分為三類：
⑴普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，最大相對(duì)離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)，電機(jī)的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動(dòng)電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個(gè)硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會(huì)損壞離心機(jī)。
⑵高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm(r/min)，最大相對(duì)離心力為89000×g，最大容量可達(dá)3升，分離形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動(dòng)式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C，轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制，并有指針或數(shù)字顯示，通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器如核蛋白體或單個(gè)分子。
⑶超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)50000～80000rpm，相對(duì)離心力最大可達(dá)510000×g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級(jí)分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。
超速離心機(jī)主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，并由微機(jī)進(jìn)行控制，由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑較細(xì)，因而在旋轉(zhuǎn)時(shí)此細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以適應(yīng)轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡，而不致于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)軸損傷，除速度控制系統(tǒng)外，還有一個(gè)過速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測(cè)離心腔的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控，這種紅外線溫控比高速離心機(jī)的熱電偶控制裝置更敏感，更準(zhǔn)確。
超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機(jī)的主要區(qū)別。離心機(jī)的速度在2000rpm以下時(shí)，空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱，速度超過20000rpm時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大，當(dāng)速度在40000rpm以上時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴(yán)重問題，為此，將離心腔密封，并由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達(dá)到所需的超高轉(zhuǎn)速。
2.轉(zhuǎn)頭：
⑴角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4～12個(gè)裝離心管用的機(jī)制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20～40度之間，角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，且重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平衡，壽命較長(zhǎng)，顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對(duì)流擾亂，影響分離效果。
⑵蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶(離心套管)構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，吊桶垂直懸掛，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時(shí)，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點(diǎn)是顆粒沉降距離長(zhǎng)，離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。
⑶區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點(diǎn)，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。
⑷垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時(shí)間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。
⑸連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。
3.離心管：
離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。
不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。
塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：
①防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，這點(diǎn)尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。
4.分析性離心機(jī)：
分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。
分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應(yīng)力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過一個(gè)有柔性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上，轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有2～6個(gè)裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí)，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。
分析性超速離心機(jī)和主要特點(diǎn)就是能在短時(shí)間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計(jì)算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴(kuò)散，估計(jì)分子的大小，檢測(cè)分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測(cè)定生物大分子的分子量，還可以檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象變化等。
制備性超速離心的分離方法：
1.差速沉降離心法：
這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。
差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。
2.密度梯度區(qū)帶離心法(簡(jiǎn)稱區(qū)帶離心法)：
區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會(huì)擠壓變形，能保持顆�；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。
此法的缺點(diǎn)是：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴(yán)格，不易掌握。
密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：
(1)差速區(qū)帶離心法：當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(shí)(不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差)。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒(20%的沉降系數(shù)差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒(如線粒體，溶酶體等)不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28kg/cm3和60％。
此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間
(2)等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。
離心時(shí)，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動(dòng)到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長(zhǎng)離心時(shí)間和提高轉(zhuǎn)速已無意義，處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時(shí)間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時(shí)間，離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)(即平衡點(diǎn))的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。
等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。
等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達(dá)1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。
收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：
(1)用注射器和滴管由離心管上部吸出。
(2)有針刺穿離心管底部滴出。
(3)用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。
(4)用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動(dòng)部分收集器收集。
離心操作的注意事項(xiàng)
高速與超速離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。
1.使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過各個(gè)離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。
2.裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
3.若要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。
4.離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察離心機(jī)上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時(shí)排除故障。
5.每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時(shí)，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時(shí)間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時(shí)，則須按規(guī)定降速使用。
一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時(shí)則以“g”表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報(bào)告超離心條件時(shí)，通常總是用地心引力的倍數(shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因?yàn)樗梢哉鎸?shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動(dòng)態(tài)變化。科技文獻(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值(RCFav)，即離心管中點(diǎn)的離心力。
為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole和Cotzias利用RCF的計(jì)算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對(duì)離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計(jì)算法方便(列線圖參見附錄)。換算時(shí)，先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺左邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值。
離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型
離心機(jī)可分為工業(yè)用離心機(jī)和實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)，制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為(用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè))，能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。
1.制備性離心機(jī)可分為三類：
⑴普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，最大相對(duì)離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)，電機(jī)的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動(dòng)電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個(gè)硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會(huì)損壞離心機(jī)。
⑵高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm(r/min)，最大相對(duì)離心力為89000×g，最大容量可達(dá)3升，分離形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動(dòng)式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C，轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制，并有指針或數(shù)字顯示，通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器如核蛋白體或單個(gè)分子。
⑶超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)50000～80000rpm，相對(duì)離心力最大可達(dá)510000×g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級(jí)分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。
超速離心機(jī)主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，并由微機(jī)進(jìn)行控制，由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑較細(xì)，因而在旋轉(zhuǎn)時(shí)此細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以適應(yīng)轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡，而不致于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)軸損傷，除速度控制系統(tǒng)外，還有一個(gè)過速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測(cè)離心腔的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控，這種紅外線溫控比高速離心機(jī)的熱電偶控制裝置更敏感，更準(zhǔn)確。
超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機(jī)的主要區(qū)別。離心機(jī)的速度在2000rpm以下時(shí)，空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱，速度超過20000rpm時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大，當(dāng)速度在40000rpm以上時(shí)，由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴(yán)重問題，為此，將離心腔密封，并由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達(dá)到所需的超高轉(zhuǎn)速。
2.轉(zhuǎn)頭：
⑴角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4～12個(gè)裝離心管用的機(jī)制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20～40度之間，角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，且重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平衡，壽命較長(zhǎng)，顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對(duì)流擾亂，影響分離效果。
⑵蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶(離心套管)構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，吊桶垂直懸掛，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時(shí)，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點(diǎn)是顆粒沉降距離長(zhǎng)，離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。
⑶區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點(diǎn)，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。
⑷垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時(shí)間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。
⑸連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。
3.離心管：
離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。
不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。
塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：
①防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，這點(diǎn)尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。
4.分析性離心機(jī)：
分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。
分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應(yīng)力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過一個(gè)有柔性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上，轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有2～6個(gè)裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí)，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。
分析性超速離心機(jī)和主要特點(diǎn)就是能在短時(shí)間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計(jì)算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴(kuò)散，估計(jì)分子的大小，檢測(cè)分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測(cè)定生物大分子的分子量，還可以檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象變化等。
制備性超速離心的分離方法：
1.差速沉降離心法：
這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。
差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。
2.密度梯度區(qū)帶離心法(簡(jiǎn)稱區(qū)帶離心法)：
區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會(huì)擠壓變形，能保持顆�；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。
此法的缺點(diǎn)是：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴(yán)格，不易掌握。
密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：
(1)差速區(qū)帶離心法：當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(shí)(不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差)。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒(20%的沉降系數(shù)差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒(如線粒體，溶酶體等)不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28kg/cm3和60％。
此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間
(2)等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。
離心時(shí)，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動(dòng)到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長(zhǎng)離心時(shí)間和提高轉(zhuǎn)速已無意義，處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時(shí)間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時(shí)間，離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)(即平衡點(diǎn))的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。
等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。
等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達(dá)1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。
收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：
(1)用注射器和滴管由離心管上部吸出。
(2)有針刺穿離心管底部滴出。
(3)用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。
(4)用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動(dòng)部分收集器收集。
離心操作的注意事項(xiàng)
高速與超速離心機(jī)是生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時(shí)都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。
1.使用各種離心機(jī)時(shí)，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時(shí)重量之差不得超過各個(gè)離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍，每個(gè)離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對(duì)不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須互相對(duì)稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。
2.裝載溶液時(shí)，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
3.若要在低于室溫的溫度下離心時(shí)。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。
4.離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察離心機(jī)上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時(shí)排除故障。
5.每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時(shí)，使用轉(zhuǎn)頭時(shí)要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時(shí)間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時(shí)，則須按規(guī)定降速使用。
標(biāo)簽：
醫(yī)用離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)
- 微量冷凍離心機(jī)、加熱磁力攪拌器和搖床在Western Blot實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
- 離心機(jī)在外泌體純化中的應(yīng)用
- 蛋白質(zhì)離心與真空濃縮技術(shù)的原理、優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用區(qū)別
- OHAUS實(shí)驗(yàn)室設(shè)備應(yīng)用于改善細(xì)胞培養(yǎng)工作流程
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