多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。到現(xiàn)在，人們已在人體中發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種肽類，關(guān)于多肽的研究與應(yīng)用，也取得了巨大的進(jìn)步，引發(fā)了空前的研究熱潮。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值，多肽研究成為了醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究的重點對象，世界各先進(jìn)國家無不撥出巨款來建立各種規(guī)模的多肽研究中心，以期在這一重要領(lǐng)域中取得突破性進(jìn)展�，F(xiàn)在具有生物活性的多肽已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在臨床檢測、醫(yī)學(xué)研究、疾病防治和治療等三大方面。

 

 

多肽合成研究已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時在多肽合成方面的知識太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z）來保護(hù)α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，有機化學(xué)家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)提供了實驗和理論基礎(chǔ)。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)�來了多肽有機合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學(xué)科——固相有機合成（SPOS），為此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學(xué)獎。Merrifield經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（BOC）用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個氨基酸）。1972，Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護(hù)基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。

 

 

多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。

 

先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為FMOC固相合成法。

 

A、樹脂的選擇及氨基酸的固定

用于多肽合成的高分子的載體主要有3類：交聯(lián)聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂類樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護(hù)的氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價鍵來實現(xiàn)。

B、氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán)也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基團(tuán)除去，近年來，F(xiàn)MOC合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法。

C、成肽反應(yīng)

固相中的成肽反應(yīng)一般是將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的縮合劑(如碳二亞氨)形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。

D、裂解及合成肽鏈的純化

BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。

 

 

 

多肽固相合成技術(shù)的發(fā)明同時促進(jìn)了多肽合成的自動化。世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期，它是利用氮氣鼓泡來對反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，用計算機程序控制來實現(xiàn)有限度的自動合成。雖然在各項功能方面有著明顯的缺陷，但是它畢竟把人從實驗室里解放出來，極大地提高了工作效率。

隨著多肽科學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家也對合成儀提出了更高的要求，從而帶動了合成儀的發(fā)展。目前多肽合成儀品種繁多。從合成量上分，可分為微克級的，毫克級的，克級的和公斤級的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產(chǎn)型的和GMP生產(chǎn)型的；從自動化程度上分，可分為全自動的，半自動的和手動的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術(shù)角度上分，可分為第一代的，第二代的，和第三代的；等等。

第一代多肽合成儀標(biāo)志性特點是采用氮氣鼓泡的攪拌原理來對反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，即合成儀上反應(yīng)器是固定的，氮氣從反應(yīng)器的下方通過反應(yīng)器到上部排出，在這一過程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設(shè)計的好處是結(jié)構(gòu)簡單，成本低，但各項功能方面有著明顯的缺陷，目前采用氮氣鼓泡方式的第一代多肽合成儀已大部分退出了市場。

 

第二代多肽合成儀標(biāo)志性特點是用不完全性的機械攪拌來取代氮氣鼓泡，一般可分為接觸式攪拌與非接觸式攪拌兩種。

接觸式攪拌常見的攪拌方式是伸入反應(yīng)器內(nèi)部的螺旋槳由上部的電機帶動進(jìn)行快速旋轉(zhuǎn)，使反應(yīng)器內(nèi)部的固液兩相進(jìn)行混合。但攪拌方式帶來的不利因素如清洗障礙，合成量低，反應(yīng)死角等也不容忽視，目前全世界共大多數(shù)多肽合成儀生產(chǎn)廠商放棄了接觸式攪拌方法。

機械性非接觸式攪拌的主要原理是反應(yīng)器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。這種由反應(yīng)器本身的運動而帶動里面固液兩相混合的方法克服了接觸式攪拌帶來的缺點，合成產(chǎn)量和純度也明顯好于用氮氣鼓泡的第一代合成儀。所以機械性非接觸式攪拌成為了多肽合成儀的主流。但是由于這種攪拌方法不能真正消除反應(yīng)死角，所以科學(xué)家們并沒有滿足而停下他們追求完美的腳步。

 

第三代多肽合成儀其反應(yīng)器轉(zhuǎn)動方式有別于前兩代的多肽合成儀，即反應(yīng)器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動反應(yīng)器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達(dá)到反應(yīng)器的最上方，真正做到了無死角。無死角多肽合成儀的另一種方式是反應(yīng)器在數(shù)控馬達(dá)的帶動下作上下180度的翻轉(zhuǎn)運動。固相和液相在運動過程中不斷從反應(yīng)器的一端到達(dá)另一端再返回來。一般用這種儀器合成出來的肽純度是最高的，且適合于擴大生產(chǎn)。

 

隨著多肽藥物科研和生產(chǎn)的不斷升溫，市場對儀器的需求還會持續(xù)增長，現(xiàn)在全世界已有十幾家公司專門從事多肽合成的研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。其中，多肽合成儀的商業(yè)化開發(fā)相對成熟，美國的CEM公司是世界上非常有影響的多肽合成儀提供商，它開發(fā)的Liberty研究級微波多肽合成儀，能一次性合成長達(dá)111個氨基酸的多肽，創(chuàng)造單次合成多肽的最長記錄，是目前市場占有率增長速度最快的研究級全自動多肽合成儀，并被美國Brookhaven國家實驗室以及安進(jìn)公司應(yīng)用于SARS和艾滋病的藥物研究。此外，美國的PTI公司已經(jīng)發(fā)展成為集多肽合成儀制造、多肽合成試劑生產(chǎn)、以及其它相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)及技術(shù)支持的大公司，其產(chǎn)品線囊括了多通道，生產(chǎn)型等各個層次滿足科研用戶及企業(yè)的需求；美國PSI公司首次研制出世界上第一臺擁有獨立知識產(chǎn)權(quán)的、完全符合美國FDA認(rèn)證要求的大規(guī)模全自動多肽合成儀，建立了在本領(lǐng)域內(nèi)的領(lǐng)先地位，PSI的6大系列多肽合成儀能全面滿足各類用戶的多種需求，并可根據(jù)客戶需求量身訂制合成儀；美國ABI公司前兩年推出的433系列全自動多肽合成儀，為學(xué)者和機構(gòu)提供了針對的服務(wù)良好的技術(shù)支持；美國CS Bio公司開發(fā)了各種規(guī)模的全系列多肽合成儀，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，已經(jīng)成為全球性多肽合成儀生產(chǎn)商，公司產(chǎn)品遍布全球，由于其優(yōu)良的產(chǎn)品性能和良好的用戶口碑，CS Bio合成儀在中國的市場份額相當(dāng)可觀；美國AAPPTEC公司成立于2005年3月，公司的前身是ACT（Advanced ChemTech）公司的儀器部，近年來，AAPPTEC公司在全自動多肽合成儀領(lǐng)域，針對不同的需求研發(fā)出數(shù)十種類型的儀器，加上長期實際應(yīng)用驗證的可靠性，這些儀器均可滿足不同客戶的不同需求，而且使用起來都相當(dāng)便利。

 

 

固相多肽合成已經(jīng)有近50年的歷史了，其技術(shù)亦比較成熟,多肽合成技術(shù)不斷完善,從小規(guī)模、短肽鏈合成發(fā)展到大規(guī)模、長肽鏈的合成�；瘜W(xué)多肽制備蛋白質(zhì)與從純化蛋白質(zhì)開始制備抗體比較，不僅省時省事省錢，而且特異性高。通常從蛋白質(zhì)序列中選擇、合成多肽到制備出抗體，只需2-3個月，而從基因表達(dá)、蛋白質(zhì)純化到抗體產(chǎn)生至少需要2-3年，而且蛋白質(zhì)家族成員和種間的特異性不能保證。例如，2003 年上市的抗愛滋病藥物T-20就是一個全合成的36個氨基酸殘基組成的小肽藥物。上世紀(jì)90年代,組合化學(xué)與多肽合成技術(shù)相結(jié)合后,又出現(xiàn)了組合肽庫的合成,對化學(xué)、生化、醫(yī)藥、分子生物學(xué)等領(lǐng)域起到了巨大的推動作用，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，在多肽研究發(fā)展過程中,對保護(hù)氨基酸的要求也不斷提高,使之不斷改進(jìn)，對于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方法，而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法，以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。至今，人們的要求已經(jīng)從合成一些較短的肽鏈，延伸到了能否利用從生物體合蛋白質(zhì)的原理，研究合成出人們理想的任意肽段，這也是今后多肽合成的發(fā)展趨勢。