1.  細(xì)胞系：CHO-M1細(xì)胞系，表達(dá)內(nèi)源G蛋白偶聯(lián)毒草堿1膽堿受體（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 親本CHO-K1細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

2.  抗體：兔抗ChRM1-PE標(biāo)記，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，無(wú)標(biāo)記；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE標(biāo)記，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。

3.  培養(yǎng)基：Ham’s F12培養(yǎng)基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。

4.  反應(yīng)緩沖液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 無(wú)菌水稀釋，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080).  pH 調(diào)整到7.4。

5.  FLIPR® Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。

6.  微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。

7.  M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。

儀器概述

ClonePix 2 系統(tǒng)

1.  篩選和挑取哺乳細(xì)胞克隆的自動(dòng)化系統(tǒng)

2.  白光和熒光成像

3.  透射光支持低對(duì)比度克隆如單層貼壁細(xì)胞成像

4.  軟件控制5對(duì)激發(fā)/發(fā)射濾光片的切換

5.  用戶自定義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行克隆排序

6.  目標(biāo)克隆識(shí)別和挑取到96孔目標(biāo)板

7.  支持懸浮和貼壁細(xì)胞的多種應(yīng)用

     1.  篩選和挑取分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞

     2.  細(xì)胞系開發(fā)

 

CloneSelect Imager

1.  無(wú)標(biāo)記的白光細(xì)胞成像技術(shù)

2.  客觀、定量評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)

3.  簡(jiǎn)單、容易使用的軟件界面

4.  準(zhǔn)確獲取96孔板每個(gè)孔細(xì)胞的生長(zhǎng)率

5.  支持多種應(yīng)用：

     1.  監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)

     2.  單克隆驗(yàn)證

 

FLIPR Tetra 系統(tǒng)

1.  標(biāo)準(zhǔn)EMCCD熒光檢測(cè)或可選ICCD熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

2.  用戶可配置96-、384-、和1536孔板

3.  用戶可更換的懸浮細(xì)胞選項(xiàng)

4.  獨(dú)特的，可配置激發(fā)光學(xué)拓展了熒光種類的應(yīng)用

5.  直觀、容易使用的軟件界面

 

半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞

CHO-M1和CHO-K1細(xì)胞系：CHO-M1和親本CHO-K1細(xì)胞種在CloneMedia CHO（K8710）培養(yǎng)基中，每孔1000個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)8-10天直到離散克隆形成。新傳代的細(xì)胞和前幾代的細(xì)胞分別種在培養(yǎng)基中，觀察M1 GPCR的不同表達(dá)水平。

 

直接標(biāo)記的方法：PE標(biāo)記的CHRM1抗體隨細(xì)胞直接加到半固體培養(yǎng)基中。對(duì)照孔包括細(xì)胞但是沒有抗體。

 

雙抗體方法：直接標(biāo)記的方法沒有效果的時(shí)候，用一抗和二抗測(cè)試可行性。非標(biāo)記的rabbit anti-muscarinic抗體和PE標(biāo)記的抗兔多克隆二抗隨細(xì)胞直接加到半固體培養(yǎng)基中。對(duì)照孔包含細(xì)胞但沒有抗體，連同僅僅含有二抗的對(duì)照孔。

 

ClonePix2系統(tǒng)成像和挑取表達(dá)GPCR(M1)的細(xì)胞克隆

 

ClonePix2 成像和挑取陽(yáng)性（CHO-M1）和陰性（CHO-K1）細(xì)胞。明場(chǎng)成像識(shí)別每個(gè)克隆的位置和形態(tài)，熒光成像識(shí)別高表達(dá)的M1。對(duì)PE標(biāo)記的抗體，使用Cy5通道曝光6,000ms。

無(wú)論是直接標(biāo)記方法還是雙抗體方法，根據(jù)ClonePix2的記錄，CHO-M1陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生大范圍的熒光信號(hào)。圖1顯示了M1 GPCR不同程度的表達(dá)。正如預(yù)期，親本CHO-K1細(xì)胞沒有產(chǎn)生熒光信號(hào)。

細(xì)胞基于形態(tài)和熒光強(qiáng)度被分組。挑取克隆的形態(tài)基于大小、形狀和克隆之間的鄰近度。形態(tài)學(xué)理想的克隆根據(jù)內(nèi)部熒光強(qiáng)度排名，并設(shè)門分為四個(gè)熒光組：高、中、CHO-K1陰性和ungated（圖2）. CHO-K1陰性組被定義為背景熒光信號(hào)。所有的克隆識(shí)別對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照孔。Ungated克隆是指低熒光信號(hào)但高于背景熒光信號(hào)的克隆。

直接標(biāo)記抗體和雙抗體的方法（圖3）顯示了陽(yáng)性樣品（表達(dá)M1）的熒光信號(hào)和無(wú)熒光信號(hào)的親本細(xì)胞系（圖4）。正如預(yù)期，由于一抗和二抗結(jié)合，雙抗體的方法在PE通道產(chǎn)生了更高的背景信號(hào)。然而ClonePix2在明場(chǎng)檢測(cè)細(xì)胞，然后再看細(xì)胞克隆內(nèi)的熒光信號(hào)。在PE通道中識(shí)別到但在明場(chǎng)識(shí)別不到的物體不被當(dāng)做是克隆。因此，ClonePix2系統(tǒng)好處是具有從背景信號(hào)中區(qū)分真實(shí)克隆的能力。

 

ClonePix2系統(tǒng)挑取的克隆CHO-M1儲(chǔ)存到含200μL Ham’s F12 media+10%FBS+G418的96孔Greiner板，而CHO-K1克隆儲(chǔ)存到同樣的微孔板但不包括G418。這些96孔板在CloneSelect Imager系統(tǒng)中成像確認(rèn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)（圖5）。細(xì)胞培養(yǎng)一周后再使用CloneSelect Imager分析確保細(xì)胞已經(jīng)增殖（圖5和6）。細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移到384孔板，用FLIPR Tetra系統(tǒng)和鈣6試劑進(jìn)行功能確認(rèn)。

 

 

 

FLIPR Tetra系統(tǒng)驗(yàn)證ClonePix2挑取細(xì)胞的M1 GPCR表達(dá)

細(xì)胞準(zhǔn)備

ClonePix2系統(tǒng)挑取的細(xì)胞種到384孔，每孔25μL培養(yǎng)基，5,000個(gè)細(xì)胞，37℃,95%濕度和5%CO₂過夜培養(yǎng)。這些細(xì)胞分選為四個(gè)組：高、中、低和no M1表達(dá)。

 

加入鈣敏感熒光染料

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡。25μL的FLIPR Calcium 6 染料直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞板。這些板孔中加入2.5Mm的丙磺舒阻止有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，37℃孵育2小時(shí)。室溫保持直到熒光讀數(shù)。

 

FLIPR Tetra 熒光成像讀板儀

孵育和室溫平衡后，放一塊板到FLIPR系統(tǒng)中，F(xiàn)LIPR系統(tǒng)ICCD相機(jī)捕獲熒光鈣信號(hào)，成像參數(shù)如下：

曝光（sec）          0.53

激發(fā)LED(nm)         470-495

發(fā)射濾光片(nm)       515-575

LED 強(qiáng)度(%)          80%

 

FLIPR 鈣6 試劑盒

每秒熒光讀數(shù)，分別在加Carbachol之前讀10個(gè)點(diǎn)，加40nm的Carbachol之后讀60點(diǎn)。Carbachol的起始濃度是終濃度的5倍。Carbachol的加入體積是12.5μL ，分液速度是20μL/sec.

 

FLIPR Calcium 6試劑盒驗(yàn)證挑好的CHO-M1和CHO-K1細(xì)胞克隆

膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體表達(dá)水平用標(biāo)記PE的抗M1最新傳代細(xì)胞和初始的CHO-M1細(xì)胞，預(yù)期的結(jié)果是初始的CHO-M1細(xì)胞M1 GPCR的表達(dá)水平將大大低于最新傳代的細(xì)胞。親本的CHO-K1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

受配體GPCR的激活，受體構(gòu)象的改變觸發(fā)胞內(nèi)G蛋白的激活�；罨�的G蛋白具有誘導(dǎo)胞內(nèi)的不同信使包括鈣信使的潛能。

 

ClonePix2系統(tǒng)挑取的不同組細(xì)胞用FLIPR Tetra系統(tǒng)來評(píng)價(jià)功能活性。在40nM的Carbachol條件下，鈣敏感熒光染料（FLIPR Calcium 6 Assays kit, Molecular Devices）用來評(píng)估胞漿中鈣離子隨著激活的G蛋白偶聯(lián)IP3敏感通路的變化而變化的可行性研究。歷史數(shù)據(jù)表明，40nM Carbachol 是 EC80的濃度。

 

在高熒光的CHO-M1細(xì)胞克隆中，相對(duì)背景，Carbachol產(chǎn)生了增加4倍的熒光讀數(shù)（圖7A）。在混合中和低熒光的CHO-M1細(xì)胞克隆中，Carbachol分別產(chǎn)生了4倍到2倍的熒光讀數(shù)增加（圖7B）。最后陰性對(duì)照的CHO-K1細(xì)胞，Carbachol沒有引起熒光讀數(shù)的任何變化（圖7C）。由于每組細(xì)胞，除了中和低表達(dá)熒光的混合細(xì)胞，是分別種在不同的384孔板中，在加入40nM的Carbachol之前，每孔基線熒光強(qiáng)度的變化都進(jìn)行了背景熒光的均一化。

 

這些結(jié)果支持了在膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體表達(dá)水平和功能活性之間的正相關(guān)性。缺乏熒光信號(hào)的CHO-K1細(xì)胞陰性對(duì)照進(jìn)一步確認(rèn)了ClonePix2系統(tǒng)能準(zhǔn)確區(qū)分表面表達(dá)M1 GPCR 的細(xì)胞和表面沒有表達(dá)M1 GPCR的細(xì)胞。

 

總結(jié)

為了滿足高通量篩選和選擇性需求分析，GPCR轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是細(xì)胞功能試驗(yàn)強(qiáng)有力、獨(dú)特和規(guī)范的研究平臺(tái)。本文的結(jié)論是初步的研究揭示了ClonePix2系統(tǒng)能可靠地檢測(cè)GPCR不同表達(dá)水平的細(xì)胞克隆。而且，熒光強(qiáng)度和FLIPR Tetra系統(tǒng)測(cè)定的GPCR介導(dǎo)的胞漿內(nèi)鈣離子水平的變化呈現(xiàn)正關(guān)聯(lián)，這些鈣離子的變化恰恰膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體M1表達(dá)差異導(dǎo)致的。

 

ClonePix2系統(tǒng)能夠有效用于檢測(cè)和挑取不同GPCR表達(dá)水平的細(xì)胞克隆，因此為需要高質(zhì)量GPCR蛋白的各種應(yīng)用提供了唯一的資源，這些應(yīng)用包括（1）使用高表達(dá)天然表位的抗原生產(chǎn)相應(yīng)的抗體；（2）表達(dá)GPCRs困難的特殊GPCR家族的細(xì)胞功能分析。