Western Blot全自動分析儀與傳統(tǒng)WB方法的比較，傳統(tǒng)Western blot方法是利用抗原的免疫反應(yīng)，先將蛋白通過SDS-PAGE電泳分離開來，然后再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體（硝酸纖維素膜即NC膜）上，然后再加形成抗原復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將結(jié)果顯示到膜或底片上。其實驗步驟主要包括以下幾個：

1、根據(jù)要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDS－PAGE）
2、將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。
3、設(shè)計加樣順序，作好實驗記錄，按預(yù)定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點樣，重組蛋白按1-2ug/道點樣。
4、把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至100V電泳10-20min，待溴酚藍(lán)遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關(guān)閉電源。
5、從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。
二．轉(zhuǎn)膜

1、 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡幾分鐘。
2、 帶上手套，準(zhǔn)備好濾紙和NC膜，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。
3、 打開轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的濾紙。
4、 按“海綿—濾紙—凝膠—NC膜—濾紙—海綿”的順序裝置好（注意不能有氣泡且裝置電極槽不能放反）
5、將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。
6、將整個裝置放在冰浴中用磁力攪拌器攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒流300mA轉(zhuǎn)移90min。電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜作好記號置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時或4℃過夜。

1．封閉：

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2．結(jié)合一抗：

一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時每張3×9cm²膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。

3．洗滌：

一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．結(jié)合二抗：

根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。

5．洗滌：

二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

一最常用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）顯色法。通常需要暗室，或?qū)�業(yè)的化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（）以及分析軟件進(jìn)行分析。

不難看出其步驟的繁雜性，這其中每一步的失誤都會造成全盤失敗，從而重復(fù)實驗，對于珍貴樣品，更是要倍加小心。另外，試驗流程長，結(jié)果重復(fù)性差，要達(dá)到好的實驗結(jié)果，成本也會很高。同時，所需實驗儀器如，電泳、轉(zhuǎn)印、成像分析（或暗室）等的操作也較為復(fù)雜，增加了實驗的難度。在傳統(tǒng)方法下，如果想得到一個較為理想的實驗結(jié)果，往往需要實驗者有著非常高超的實驗技巧和嫻熟的實驗儀器操作經(jīng)驗。所以，科學(xué)家們一直在尋找一種革新的技術(shù)來克服Western傳統(tǒng)技術(shù)的不足，發(fā)揚它的優(yōu)勢，直到2011年底，專門從事蛋白質(zhì)分析研究技術(shù)的美國ProteinSimple公司經(jīng)過多年開發(fā)，在全球推出獨一無二的全自動Western Blot分析系統(tǒng)Simon，從而使Western實驗變得簡單，高效。

全自動Western Blot分析系統(tǒng)Simon將Western blot的所有實驗步驟自動化，包括蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測以及數(shù)據(jù)的定量分析，即保證了實驗結(jié)果的重復(fù)性。

操作者只需簡單的放上樣品，然后敲擊“開始”，就可以離開。只需約三個小時后，即可回來讀取已經(jīng)分析好的數(shù)據(jù)結(jié)果。，如果不確定整個過程的分析時間，Simon^TM在實驗結(jié)束后會以聲音提醒，一起就是如此簡單！

它主要是在400nl樣品管中完成Western blot的所有實驗，僅需5ul的樣品量，節(jié)約珍貴樣本；結(jié)果具有高度重復(fù)性，CV≤10%。自動化上樣機(jī)具有多個參數(shù)可自行設(shè)定，包括分離時間、封閉時間、一抗和二抗孵育時間、檢測時間。

實驗數(shù)據(jù)的分析是由Compass軟件自動處理，樣品數(shù)據(jù)的表現(xiàn)形式與傳統(tǒng)的結(jié)果保持一致并具有更好的靈敏度與重復(fù)性。提高了分析系統(tǒng)定量的準(zhǔn)確性。

介紹完以上兩種方法，我們在此簡單地總結(jié)Western Blot全自動分析儀與傳統(tǒng)WB方法的比較：

一、      自動化程度不同：傳統(tǒng)的WB方法需要跑膠、轉(zhuǎn)膜、抗體雜交以及發(fā)光成像與分析多個步驟，每個步驟都需要依靠經(jīng)驗和摸索進(jìn)行，且每個步驟之間需要人工操作，直至得到分析結(jié)果。而全自動WB分析儀僅需要簡單的放入樣品和相應(yīng)程序的設(shè)置，然后有系統(tǒng)直接得出結(jié)果，整個過程全自動化，實驗過程簡單易操作。

二、      實驗重復(fù)性不同:傳統(tǒng)WB方法繁雜的實驗步驟、較長的實驗周期以及其幾乎全部手動操作的實驗方式直接決定了其較低的實驗重復(fù)性。幾乎其中每一步的失誤都會給實驗結(jié)果造成差異性較大的實驗結(jié)果，特別是對于初級實驗操作人員，如果想得到較為可信的實驗結(jié)果幾乎要接受大量的技能培訓(xùn)與許多次的失敗教訓(xùn)。

三、      實驗時間（效率）不同：傳統(tǒng)WB方法需要幾乎兩天的時間，而全自動Western blot分析儀僅需要數(shù)小時時間即可獲得實驗數(shù)據(jù)。

四、      實驗成本不同：傳統(tǒng)的WB方法需要樣品量較大，在幾乎完美無失誤的實驗過程也需要多種較為高昂的實驗試劑耗材及大量的時間和人力投入，如果實驗失敗其實驗成本有時幾乎不可預(yù)測。而全自動Western blot分析儀僅需不超過5ul的樣品量和少量且經(jīng)濟(jì)的實驗試劑耗材，在數(shù)小時內(nèi)即可獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)，實驗成本低廉且可估計，對于一些關(guān)鍵實驗來說幾乎最大程度的保證了實驗方案甚至是項目的順利進(jìn)行。

當(dāng)然，Western Blot全自動分析儀因其專業(yè)性強儀器購置價格略微較高，目前其受眾僅為有著大量、專業(yè)、高效率實驗需求的用戶。而普通WB方法中的各種儀器設(shè)備幾乎可以兼做其他各種凝膠成像實驗，適用性更廣。