腫瘤學研究之評價細胞遷移的高通量成像檢測法
腫瘤學研究之——評價細胞遷移的高通量成像檢測法
在研究諸如轉(zhuǎn)移性腫瘤、炎癥和慢性疾病中，觀察細胞的遷移是一個很重要的方法。檢測細胞遷移的方法有助于更清楚的了解疾病的機制，對于藥物和治療效果的評判也是極其重要的。我們介紹一種新的方法，即結(jié)合MD ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)和Oris 細胞遷移檢測板，用以檢測細胞的遷移。
Oris細胞遷移檢測板是一個96孔板形式的耗材，硅膠塊能夠封閉住的中心區(qū)域，使中間區(qū)域無法鋪種細胞。當硅膠塊移除后，周圍細胞遷移進入中心區(qū)域，此時可以使用活細胞試劑，如Calcein-AM進行熒光標記，或?qū)⒓毎潭ê髽擞浖毎诉M行檢測分析。
使用ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)能夠進行整孔成像，因此能夠高速高效的獲取孔內(nèi)遷移區(qū)域的圖像。
介紹
Oris 細胞遷移板使用硅膠塊封閉96孔板每個孔的中心區(qū)域，使中心區(qū)域無法鋪種細胞，從而在孔中心獲得一個直徑2mm的環(huán)形檢測區(qū)域，當細胞發(fā)生遷移，周圍的細胞會遷移進入中心監(jiān)測區(qū)域。Oris細胞遷移板提供多種細胞外基質(zhì)，如I型膠原和纖維粘連蛋白，鋪涂于96孔板，用于細胞遷移實驗。我們采用了HT-1080和MDA-MB-231細胞在鋪有三種不用細胞外基質(zhì)的Oris板上研究不同水平MEK抑制劑U0126對細胞遷移的作用。該實驗中，我們可以看到ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)能夠快速方便的獲得每個孔內(nèi)包含監(jiān)測區(qū)域的圖像。軟件系統(tǒng)能夠自動計算孔中心監(jiān)測區(qū)域遷移細胞所占據(jù)的面積，從而快速獲得實驗結(jié)果。
材料
●Oris細胞遷移檢測板
●HT-1080纖維肉瘤細胞
●MDA-MB-231乳腺癌細胞
●HT-1080細胞培養(yǎng)液：含有10%高溫滅火FBS的EMEM，抗生素，碳酸氫鈉，丙酮酸鈉。
●PBS
●8%戊二醛
●Triton X-100
●DMSO
●MEK抑制劑U0126
●PI
●ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)
實驗方法
1. 將HT-1080和MDA-MB-231細胞以30000細胞/孔的密度種植于三種細胞外基質(zhì)包被的Oris細胞遷移板中（圖1）。在37度下培養(yǎng)6小時，使細胞牢固貼壁。
2. 6小時后，除對照孔外，移除Oris板上的封閉硅膠（1,5,9列）
3. 在37度下，孔內(nèi)加入0.1% DMSO或MEK抑制劑U0126，孵育16小時，使細胞發(fā)生自由遷移。
4. 以0.25%戊二醛固定細胞，以0.1%Triton X-100破膜。
5. PBS沖洗，1ug/mL PI室溫下孵育30分鐘。無需二次沖洗。
6. 樣品放入ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)，在2X物鏡下和標準的Cy3濾色片組進行細胞成像。在2X鏡下，ImageXpress Micro系統(tǒng)能夠進行整孔成像，可以一次獲得整個孔內(nèi)細胞區(qū)域和檢測區(qū)域的圖像。
圖1. 包被有三種不同基質(zhì)的Oris細胞遷移板。A-D行種以HT-1080細胞，E-H行種以MDA-MB-231細胞。
結(jié)果
ImageXpress Micro系統(tǒng)獲得孔內(nèi)圖像，采用優(yōu)化的分析系統(tǒng)辨認熒光細胞并在特定區(qū)域（ROI）辨認背景。通過對中心檢測區(qū)域內(nèi)細胞的識別，可以分析出遷移進入該區(qū)域的細胞的數(shù)量。 ImageXpress Micro系統(tǒng)在5分鐘內(nèi)自動獲得全部圖像，圖像自動保存入MDCStor數(shù)據(jù)庫內(nèi)，當需要時，可以進行所有圖像的自動分析。
圖2. ImageXpress Micro系統(tǒng)2x鏡頭下獲得的孔內(nèi)圖像。右圖顯示環(huán)狀檢測區(qū)域。
實驗結(jié)果顯示，HT-1080和MDA-MB-231細胞在膠原包被的孔內(nèi)的遷移數(shù)量要高于未包被或纖維粘連蛋白包被。可以看到，HT-1080細胞遷移占據(jù)了較MDA-MB-231細胞更多的中間ROI區(qū)域。
圖3. 結(jié)果顯示，兩種細胞在膠原包被表面較未包被或纖維粘連蛋白包被表面遷移更加明顯。
MEK抑制劑U0126對不同表面包被孔內(nèi)細胞都表現(xiàn)出了劑量依賴性抑制作用。但是在未包被和纖維粘連蛋白包被孔內(nèi)的抑制作用更加復雜。
同時，ImageXpress Micro在檢測過程中能夠?qū)z測區(qū)域ROI外細胞排除而只檢測ROI內(nèi)遷移細胞，因此檢測窗口大，檢測靈敏度高。
圖4. 圖表顯示，相對于對照組抑制劑的抑制百分比。U0126對于膠原表面包被孔內(nèi)細胞的抑制作用弱于其他表面包被孔內(nèi)的細胞。
總結(jié)：
●HT-1080和MDA-MB-231細胞對MEK抑制劑U0126表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。
●如結(jié)果顯示，ImageXpress Micro高內(nèi)涵系統(tǒng)適合于進行細胞遷移的研究，由于可以將ROI區(qū)域外細胞排除在外，因此檢測窗口大，檢測靈敏度高。
●Oris細胞遷移板使用方便，易于操作，可用于活細胞或固定細胞（活細胞數(shù)據(jù)未展示）
