氫氘交換質(zhì)譜法是一種研究蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的質(zhì)譜技術(shù)。它在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、蛋白表位及活性位點(diǎn)鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用。隨著氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，它正在成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)家及生物藥物研發(fā)的重要手段。

 

氫氘交換質(zhì)譜（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一種研究蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的質(zhì)譜技術(shù)。其原理是將蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換，而且蛋白質(zhì)表面與重水密切接觸的氫比位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快，進(jìn)而通過質(zhì)譜檢測確定蛋白質(zhì)不同序列片段的氫氘交換速率，從而得出蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)信息[1]。這個(gè)過程就像將握著的拳頭浸入水中，然后提出水面并張開手掌。這時(shí)，濕潤的手背表明它在“拳頭”的結(jié)構(gòu)中處于外表面，而較為干燥的手心表明它是“拳頭”的內(nèi)部。除樣品制備外，氫氘交換質(zhì)譜法的主要過程包括：交換反應(yīng)、終止反應(yīng)、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)解析。其中交換步驟需要在多個(gè)反應(yīng)時(shí)長下進(jìn)行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以繪制交換率曲線，得到準(zhǔn)確全面的信息。氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化研究[1]、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)[2]、蛋白表位及活性位點(diǎn)鑒定方面有著廣泛的應(yīng)用[3]。

 

與經(jīng)典的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法相比，如X射線晶體衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氫氘交換質(zhì)譜不能夠提供精確的蛋白空間結(jié)構(gòu)，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的表面位置（包括動(dòng)態(tài)變化中的）、可能的活性位點(diǎn)和蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)等。但是氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)有著其他經(jīng)典方法不具備的優(yōu)點(diǎn)：首先，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的研究是氫氘交換質(zhì)譜的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)，包括變化中的活性位點(diǎn)及表位；其次，氫氘交換質(zhì)譜在蛋白復(fù)合體構(gòu)象的研究中也具有獨(dú)到的優(yōu)勢；此外，氫氘交換質(zhì)譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低、研究對象為溶液環(huán)境下的蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象而非晶體中構(gòu)象等優(yōu)勢[1,4,5]。自1991年第一篇研究論文發(fā)表起，氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展，已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)及質(zhì)譜技術(shù)中一個(gè)非常重要的應(yīng)用領(lǐng)域[6]。但是氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜的實(shí)現(xiàn)過程在一定程度上影響了其應(yīng)用的廣泛度。主要的難點(diǎn)有：1、如何避免交換后氘代肽段的回交現(xiàn)象；2、實(shí)驗(yàn)控制的高精確性和重現(xiàn)性要求；3、交換后造成的疊加的質(zhì)譜峰如何準(zhǔn)確分辨；4、簡易高效的分析軟件需求；5、以氨基酸為單位的交換位點(diǎn)辨析。沃特世公司自2005年起，針對以上難點(diǎn)不斷進(jìn)行攻關(guān)，推出了目前唯一商業(yè)化的全自動(dòng)氫氘交換質(zhì)譜系統(tǒng)解決方案——nanoACQUITY UPLC^® HD-Exchange System(圖1)。在全世界范圍內(nèi)，這套系統(tǒng)已經(jīng)幫助科學(xué)家在包括Cell、Nature等頂級(jí)研究期刊中發(fā)表研究論文[7,8]。除科研需求外，沃特世氫氘交換質(zhì)譜系統(tǒng)也受到眾多國際領(lǐng)先制藥公司的認(rèn)可，并用于新藥開發(fā)中蛋白藥物活性位點(diǎn)及表位的研究工作中。

氫氘交換實(shí)驗(yàn)中的回交現(xiàn)象將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的產(chǎn)生。要避免回交需要做到兩點(diǎn)：盡量縮短液質(zhì)分析時(shí)間和保證液質(zhì)分析中的溫度和pH為最低回交反應(yīng)系數(shù)所要求的環(huán)境。沃特世UPLC^®系統(tǒng)采用亞二納米色譜顆粒填料，較HPLC使用的大顆粒填料，UPLC具有無與倫比的分離度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分離效果的要求下，極大縮短液相分析時(shí)間的要求[9]。對于對溫度和pH控制問題，在多年的工程學(xué)改進(jìn)中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對酶切、液相分離等步驟的全程控制[10]。

 

對氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)精確性和重現(xiàn)性的要求是其應(yīng)用的第二個(gè)主要難點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。如果進(jìn)行人工手動(dòng)實(shí)驗(yàn)，很難做到對10S-10min等幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的精確操作。再考慮到重復(fù)實(shí)驗(yàn)的需求，人工手動(dòng)操作會(huì)對最終數(shù)據(jù)可信度產(chǎn)生影響。而且實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)繁瑣，將給實(shí)驗(yàn)人員帶來非常大的工作壓力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通過智能機(jī)械臂，精確完成交換、終止交換、進(jìn)樣、酶切等一系列實(shí)驗(yàn)過程，而且始終保證各個(gè)步驟所需不同的溫度環(huán)境。這些自動(dòng)化過程不但保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，提高了實(shí)驗(yàn)效率，也將科學(xué)家從繁瑣的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中解放出來。

 

氫氘交換實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，隨著交換時(shí)間的延長，發(fā)生了交換反應(yīng)的多肽，由于質(zhì)量變大，其質(zhì)譜信號(hào)將逐漸向高質(zhì)荷比方向移動(dòng)。因此，這些質(zhì)譜峰可能與哪些未發(fā)生交換反應(yīng)的多肽質(zhì)譜峰逐漸疊加、相互覆蓋。相互疊加的質(zhì)譜信號(hào)，不但影響對峰歸屬的判斷，更會(huì)增加交換率數(shù)據(jù)的誤差。因?yàn)榻粨Q率判斷需要通過對發(fā)生交換的多肽進(jìn)行定量，毫無疑問因疊加的而混亂的質(zhì)譜數(shù)據(jù)將極大的影響對質(zhì)譜峰的準(zhǔn)確定量。這點(diǎn)對于單純通過質(zhì)荷比進(jìn)行分析的質(zhì)譜儀來說完全無能為力。但是，這個(gè)看似不可能完成的任務(wù)卻被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。這是因?yàn)椋�不同于其它常見質(zhì)譜，沃特世的SYNAPT^®質(zhì)譜平臺(tái)還具備根據(jù)離子大小及形態(tài)進(jìn)行分離的功能（行波離子淌度分離）。在數(shù)據(jù)處理時(shí)，除多肽離子的質(zhì)荷比信息外，還可以通過離子遷移時(shí)間（離子淌度維度參數(shù)）將不同離子區(qū)分。因此這種SYNPAT獨(dú)有的被命名為HDMSE的質(zhì)譜分析技術(shù)可以將因質(zhì)荷比相同而重疊的多肽分離開，輕而易舉地解決了質(zhì)譜信號(hào)疊加的問題，得到準(zhǔn)確的交換率數(shù)據(jù)[11,12]（圖2）。SYNPAT質(zhì)譜平臺(tái)一經(jīng)推出就奪得了2007年P(guān)ITTCON金獎(jiǎng)，目前已經(jīng)推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型號(hào)，并具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術(shù)外，SYNAPT質(zhì)譜系統(tǒng)在蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)研究中也是獨(dú)具特色，已有多篇高質(zhì)量應(yīng)用文獻(xiàn)發(fā)表[13,14,15]。

 

實(shí)現(xiàn)氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的第四個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，是如何高效分析實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的多時(shí)間點(diǎn)及多次重復(fù)帶來的大量數(shù)據(jù)。人工完成如此巨大的信息處理工作，將消耗科學(xué)家大量的時(shí)間。沃特世氫氘交換質(zhì)譜解決方案所提供的DynamX軟件可以為科學(xué)家提供簡便直觀的分析結(jié)果，并包含多種呈現(xiàn)方式。

 

在某些特殊研究中，要求對蛋白氫氘交換位點(diǎn)做到精確到氨基酸的測量，這是氫氘交換質(zhì)譜研究的又一個(gè)難點(diǎn)。在常規(guī)的研究中采用CID（碰撞誘導(dǎo)解離）碎裂模式，可能導(dǎo)致氘原子在多肽內(nèi)重排，而致使不能對發(fā)生交換的具體氨基酸進(jìn)行精確定位。SYNPAT質(zhì)譜提供的ETD（電子轉(zhuǎn)移解離）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混亂，并具有良好的碎裂信號(hào)[16]。

 

沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System為氫氘交換質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)提供了前所未有的簡易的解決方案，強(qiáng)有力地推動(dòng)了氫氘交換技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化研究、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、蛋白表位以及活性位點(diǎn)鑒定方面的應(yīng)用，正在成為眾多結(jié)構(gòu)生物學(xué)科學(xué)家和生物制藥企業(yè)必不可少的工作平臺(tái)。

 

(1) John R. Engen, Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009,81, 7870–7875

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(3) Tiyanont K, Wales TE, Aste-Amezaga M, et al. Evidence for increased exposure of the Notch1 metalloprotease cleavage site upon conversion to an activated conformation. Structure. 2011, 19, 546-554

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