微流控芯片技術(shù)及其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

1990年，Manz和Widmer等^[1]首先提出微流控芯片的概念，自此微流控芯片技術(shù)得到了快速的發(fā)展，它具有有效降低試劑和樣品消耗、加快分析速度、提高檢測靈敏度、顯著降低分析成本等優(yōu)點(diǎn)^[2]，使得其在各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，包括基因分析、蛋白分析、天然產(chǎn)物活性成分的篩選、食品安全分析等。本文主要就微流控技術(shù)的發(fā)展過程和其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用做一簡要綜述。

1  微流控芯片技術(shù)的發(fā)展

在10~100μm寬的溝道系統(tǒng)中對流體或氣體進(jìn)行操控的技術(shù)被稱為微流控技術(shù)，以微流控技術(shù)為核心、通過微細(xì)加工技術(shù)將微管道、微泵、微閥、微儲液器、微電極、微檢測元件、窗口和連接器等功能元器件，像集成電路一樣集成在芯片材料，應(yīng)用于生物、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的芯片型微全分析系統(tǒng)被稱為微流控芯片^[3]。最早的微流控芯片是構(gòu)建在硅片上的，硅基片的微細(xì)加工技術(shù)比較成熟，材料相對比較便宜。但是硅的生物兼容性不好，而且硅基片不耐高電壓、不透明，限制了它在該領(lǐng)域的應(yīng)用^[4]。隨后石英玻璃成了主要襯底材料，石英基片的微細(xì)加工技術(shù)與硅片的類似，可以耐高壓，生物兼容性好，而且完全透明，便于檢測，但石英基片的成本較高。近年來，聚合物材料以其成本低、加工方法簡單而成為最受歡迎的材料。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是使用最廣泛的聚合物材料。目前，生物材料在微流控芯片中的應(yīng)用受到了極大關(guān)注^[4]。

1990年，瑞士研究人員Manz和Widmer首先提出微流控芯片的概念^[5]，1992年Manz研制出毛細(xì)管電泳微芯片分析裝置，開創(chuàng)了微流控芯片技術(shù)的先河，因此微流控芯片技術(shù)是在芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的^[6]。在20世紀(jì)整個90年代的研究中，微流控芯片更多的被用作一種化學(xué)分析平臺，其主要應(yīng)用于芯片電泳^[7-8]。1994年美國橡樹嶺國家實(shí)驗(yàn)室Ramsey等^[9]在Manz的工作基礎(chǔ)上改進(jìn)了芯片毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方法，提高了其性能和實(shí)用性。1995年美國加州大學(xué)佰克利分校的Mathies等^[10]在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了高速DNA測序，其商業(yè)價值開始顯現(xiàn)，同年9月首家微流控芯片企業(yè)-Caliper Technologies公司成立。1996年Mathies等又將聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳集成在一起，以后又實(shí)現(xiàn)了微流控芯片上多通道毛細(xì)管DNA測序^[11]。1998年首臺微流控分析儀器面世，隨后各種儀器和芯片如雨后春筍般上市。同年，Science上首次發(fā)表關(guān)于微流控芯片作為一種小型化的化學(xué)工廠的文章，引發(fā)了新的研究熱點(diǎn)^[12]。1999年Shi等^[13]研制出96根分離泳道的毛細(xì)管陣列電泳芯片，可在2min內(nèi)同時分離pBR322樣品。2000年，Anderson等^[14]研制了一種可用于多樣品的一系列復(fù)雜分子處理的高度集成的芯片，它可從毫升級水溶液樣品中提取濃縮的核酸，進(jìn)行微晶化學(xué)擴(kuò)增、酶反應(yīng)、雜交、混合和測定等，并可進(jìn)行十幾種反應(yīng)物的60多個連續(xù)操作。2001年，“Lab on a Chip”雜志創(chuàng)刊，它作為一種主流刊物，影響世界范圍內(nèi)相關(guān)研究的進(jìn)展。自此，微流控芯片的發(fā)展進(jìn)入了嶄新的階段；2002年，有關(guān)題為“微尺度生物分析系統(tǒng)”和“微流控芯片的大規(guī)模集成”的文章在Science上發(fā)表，這意味著微流控芯片的價值得到了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的肯定^[15-16]；2006年，Nature雜志發(fā)表“Lab on a Chip”專輯，共收錄1篇概論和8篇綜述，從不同角度闡述了芯片實(shí)驗(yàn)室的研究歷史、現(xiàn)狀和應(yīng)用前景^[17]。目前，微流控芯片技術(shù)已經(jīng)成為生命科學(xué)、藥物合成、疾病診斷、食品安全檢測等研究中的重要工具和熱點(diǎn)。

2  微流控芯片技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1  微流控芯片技術(shù)在基因檢測中的應(yīng)用

在基因檢測方面，微流控芯片技術(shù)主要應(yīng)用于核酸的擴(kuò)增、分離、測序及多肽性檢測。聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中，它可以對DNA分子進(jìn)行體外擴(kuò)增，常規(guī)的PCR過程大致需要1-2 h，需要的試劑也較多，費(fèi)時費(fèi)力，而微流控芯片技術(shù)用于PCR擴(kuò)增及相關(guān)檢測時，既能簡化操作步驟，又能顯著提高檢測效率。1998年，Kopp等^[18]提出了連續(xù)流動式微流控PCR擴(kuò)增芯片，反應(yīng)溶液循環(huán)流經(jīng)不同的溫區(qū)完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)，整個擴(kuò)增反應(yīng)全部在流動中完成，縮短了擴(kuò)增時間，減少了反應(yīng)所需的試劑。此后，很多科學(xué)家在此項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上，對連續(xù)流動式PCR技術(shù)進(jìn)行了更進(jìn)一步的改進(jìn)，使其更加微型化^[19]。隨著微流控芯片技術(shù)上的不斷完善和發(fā)展，微流控分析技術(shù)能分離的DNA片段長度在逐步擴(kuò)大，可完成對DNA片段的測序和遺傳物質(zhì)的分離、分析，并且出現(xiàn)了可同時進(jìn)行平行分析的多通道微流控芯片^[19]。Mathies^[20]研究用3.5cm的有效分離長度，7min在單通道玻璃芯片上完成了長度為150～200bp的序列測定。后來他們又將分離通道延長到7.5cm，并改用四色熒光檢測器20分鐘完成500bp的序列分析，準(zhǔn)確率達(dá)99.4%。單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphism，SNP)就是人類基因組中物理圖譜的理想遺傳標(biāo)記，能滿足對代謝、生長和疾病相關(guān)基因的定位，基因多態(tài)性是人類各種可遺傳變異中常見的現(xiàn)象^[21]。SNP檢驗(yàn)方法主要是以PCR為基礎(chǔ)，通過電泳技術(shù)分辨堿基差異造成的DNA片段的各種差異來進(jìn)行基因分型。Taylor等^[22]設(shè)計了一個十字型微流控芯片對其進(jìn)行分析，探討了多種疾病與其變異存在相關(guān)性。整個分析過程由傳統(tǒng)方法的幾天時間縮短到45min。

2.2  微流控芯片技術(shù)在蛋白分析中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)是生物體最基本的生物活性物質(zhì)，蛋白質(zhì)的分離測定可以幫助人們認(rèn)識蛋白質(zhì)在生物功能中的作用，對發(fā)現(xiàn)新的診療方法有著不可估量的價值^[6]。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析步驟均由手工操作進(jìn)行，這些方法過于繁瑣、樣品消耗量大、靈敏度不高，無法滿足蛋白質(zhì)組學(xué)對分析系統(tǒng)快速、集成、高通量、高靈敏度的需求。利用微流控分析芯片系統(tǒng)對蛋白質(zhì)樣品、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行分析，其分析步驟均在幾平方厘米的分析芯片上進(jìn)行，反應(yīng)速度快，靈敏度高^[19]。另外，微流控芯片檢測技術(shù)所需要的試劑及反應(yīng)物的量均較少，可以大大減少試劑消耗^[19]。Hofmann等^[23]利用等電聚焦毛細(xì)管電泳芯片技術(shù)，以Cy5標(biāo)記肽，對細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和肌紅蛋白等9種蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離檢測，5 min完成整個檢測過程。

2.3  微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，對單細(xì)胞及胞內(nèi)的成分和形態(tài)變化進(jìn)行分析和檢測已成為研究的熱點(diǎn)。微流控芯片由于其微通道寬度(10～50μm)和生物細(xì)胞大小相當(dāng)，所以生物細(xì)胞在微通道內(nèi)非常容易操縱、觀察和檢測，以微流控芯片進(jìn)行單細(xì)胞研究具有獨(dú)特的優(yōu)越性^[19]。Shin等^[24]構(gòu)建了一種電穿孔細(xì)胞芯片，他們通過指數(shù)衰變式脈沖發(fā)生器對流體通道內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)，測量了細(xì)胞電穿孔時各種參數(shù)。近幾年人們還在細(xì)胞微環(huán)境的化學(xué)濃度梯度進(jìn)行時間和空間控制、細(xì)胞培養(yǎng)等方面進(jìn)行了大量研究。相信隨著微流控技術(shù)的不斷更新，此技術(shù)有望成為細(xì)胞研究的主要工具^[19]。

3        展望

微流控芯片技術(shù)經(jīng)過二十幾年的發(fā)展，已經(jīng)從萌芽階段不斷走向成熟，目前微流控芯片已廣泛應(yīng)用于基因測序、蛋白質(zhì)圖譜分析等生物領(lǐng)域，生命科學(xué)的發(fā)展已進(jìn)入一個非常重要的歷史時期，生命科學(xué)與化學(xué)、工程學(xué)等領(lǐng)域的交叉與結(jié)合，已是科學(xué)發(fā)展的必然。微流控芯片具有微型化、集成化及在多學(xué)科交叉方面的獨(dú)特優(yōu)勢，也被廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)等不同研究領(lǐng)域，并已取得了顯著成果，顯示出廣闊的應(yīng)用前景^[25]。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷成熟和制作成本的不斷降低，必將大規(guī)模地進(jìn)人到常規(guī)醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，取代那些笨重而且操作復(fù)雜的化驗(yàn)、檢驗(yàn)設(shè)備，進(jìn)而促進(jìn)醫(yī)療水平的進(jìn)步^[4]。

 

 

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