腫瘤早期預(yù)警的血清多肽質(zhì)譜

1. 被檢查者的基本資料的收集：
1.1 被檢查者的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、職業(yè)、民族、飲食習(xí)慣等。
1.2 被檢查者的家族的遺傳史，以往的患病與治療史，過(guò)敏等情況。
1.3 被檢查者的臨床表現(xiàn)，包括各種體癥的表現(xiàn)，如發(fā)燒，疼痛等。
1.4 被檢查者的臨床影像學(xué)的表現(xiàn)，如核磁、CT和PET等。
1.5 被檢查者的病理切片、活檢結(jié)果、細(xì)胞學(xué)觀察、腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果等臨床其它的檢測(cè)結(jié)果。

2. 血清的制備和保存：
2.1 被檢查者早上禁食，上午抽血。
2.2 采用10-20ml的一次性注射器從被檢查者的上臂的靜脈血管抽出5ml血液，抽出后，放入10ml的聚丙烯的塑料管，水平靜置，室溫30分鐘（室溫為25℃）。
2.3 在角轉(zhuǎn)頭小型離心機(jī)中于1400g，室溫，離心10分鐘。
2.4 取出上面的血清，避免取出下層的血漿，將血清分裝成100微升每小管，置于200μl的聚丙烯的塑料管中。
2.5 將裝有血清的200μl的聚丙烯的塑料管立即保存于-80℃�？杀４�6個(gè)月。

3. 運(yùn)用磁珠對(duì)血清進(jìn)行純化：
3.1  徹底渦旋混勻磁珠至少1min，以獲得均一的磁珠混懸液。
3.2  將10μl結(jié)合液和5μl樣品（如人血清）（含有的蛋白最多為500pmol）  轉(zhuǎn)移入一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的薄壁聚丙烯PCR管中。加入5μl混勻的磁珠，上下吹吸5次，小心混合液體。等待1min。
3.3  將PCR管置于一個(gè)磁隔離器（magnetic bead separator，MBS）內(nèi)，等待20sec，以將磁珠從上清液中分離。注意管內(nèi)磁珠的運(yùn)動(dòng)。
3.4  用移液器小心移去上清。避免槍頭和磁珠接觸，小心不要移動(dòng)磁珠。
3.5  將PCR管從磁隔離器中轉(zhuǎn)移出來(lái)。
3.6  為了洗滌，加入100μl洗液。
3.7  將PCR管放入磁隔離器內(nèi)，將管在臨近孔之間來(lái)回移動(dòng)20次，以洗滌磁珠。
3.8  等待20sec以聚集磁珠于管壁上，用槍小心移去上清。
3.9  重復(fù)步驟6-8兩次。
3.10 在磁珠中，加入5μl乙腈（50%），徹底混勻。等待1min。（小心：乙腈  是易揮發(fā)性的，可快速蒸發(fā)！）。
3.11 將管放置在磁隔離器內(nèi)，等待30sec以將磁珠從洗脫液中分離出來(lái)，而存留在管壁上。
2.12  最后，將含有純化的多肽/蛋白質(zhì)的洗脫液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中。

4．純化后血清樣品的質(zhì)譜分析
4.1 取1μl洗脫液加入新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中，加入10μl基質(zhì)，混勻，加1μl在Anchorchip靶板上，在空氣中干燥，約5-10分鐘。
4.2 按說(shuō)明書對(duì)質(zhì)譜儀調(diào)整參數(shù)，用外標(biāo)進(jìn)行校正，然后對(duì)樣品進(jìn)行分析。
4.3 軟件獲取數(shù)據(jù)，處理，得到每個(gè)樣品的質(zhì)譜圖。
4.4 軟件分析，建立疾病組和正常對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)譜圖，并根據(jù)差異的蛋白峰建立疾病組的特征血清多肽譜。

5．未知樣品的盲性測(cè)試
5.1 取臨床高�；蚱詹榈娜巳旱难���，按上述方法進(jìn)行資料的收集，血清的采集、保存、純化和質(zhì)譜分析。
5.2 軟件分析與統(tǒng)計(jì)，決定其歸屬疾病或健康。
5.3 與臨床金標(biāo)準(zhǔn)如病理、細(xì)胞學(xué)等進(jìn)行比較。
5.4 根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定未知樣品的盲性測(cè)試準(zhǔn)確率。