UPLC SYNAPT 二級(jí)質(zhì)譜方法用于 siRNA 寡核苷酸結(jié)構(gòu)確證

Vera B. Ivleva 、 Ying Qing Yu 和 Martin Gilar

美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德沃特世公司

簡(jiǎn)介

RNA 干涉（ RNAi ）機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后基因沉默中有根本性的作用，在已知序列的情況下，基因沉默常規(guī)實(shí)驗(yàn)可通過(guò)使用 ~21 個(gè)核苷酸（ nt ）長(zhǎng)度的合成 RNAi 探針進(jìn)行，此法也用于研發(fā)藥物。

合成 RNAi 寡核苷酸須純化以防靶點(diǎn)外的基因沉默。 RNAi 藥物需要良好的實(shí)驗(yàn)描述，以達(dá)到法規(guī)要求，將可能的安全有效性的不良作用降低到最小。

沃特世超高效液相色譜（ UPLC ® ）技術(shù)的高分離度色譜能力與質(zhì)譜聯(lián)用分析是分析 siRNA 寡核苷酸等生物藥物的有力手段。作為寡核苷酸確證的一部分，可通過(guò)選擇性酶或化學(xué)物進(jìn)行測(cè)序。二級(jí)質(zhì)譜碎片分析方法為快速通用方法，可用于修飾后的寡核苷酸（通常對(duì)酶切有抵抗力）。為獲得完整的 21 核苷酸 RNAi 的結(jié)構(gòu)信息，二級(jí)質(zhì)譜分析中其分子須有效離子化并產(chǎn)生與序列相關(guān)的離子，質(zhì)量精確性與分離度也需適當(dāng)。

本應(yīng)用手冊(cè)提供了精確 UPLC/MS/MS 分析方法用于 21 核苷酸 RNA 結(jié)構(gòu)確證的流程。該法對(duì)確認(rèn) siRNA 堿基藥物的序列是非常有用的。

實(shí)驗(yàn)條件

樣品制備

21 核苷酸長(zhǎng)度的互補(bǔ) RNA 鏈（上游序列 5’ -UCG UCA AGC GAU UAC AAG GTT -3’ ，下游序列 5’ -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3’ ）在 0.1 M 乙酸三乙胺（ TEAA ）中分別重組。

合成副產(chǎn)物的分布與上下游序列一并通過(guò) UPLC/MS 檢測(cè)。用于 UPLC/MS 分析的樣品濃度為 30 pmol/μL 。

方法

UPLC/MS 分析與前述一致。 1 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系統(tǒng)適配了 ACQUITY UPLC 寡核苷酸分離技術(shù)（ OST ） C 18 柱（ 1.7 μm ， 2.1 x 50 mm ； PN 186003949 ），質(zhì)譜參數(shù)的選擇旨在達(dá)到最佳 TEA 加合物的去聚集效果，而不影響先導(dǎo)離子強(qiáng)度。沃特世 SYNAPT™ HDMS™ 質(zhì)譜在飛行時(shí)間 TOF ）模式下操作。

選擇離子的誘導(dǎo)解離碰撞能量梯度為 25 -55 V 。 MS/MS 碎片程度通過(guò)選擇合適的電荷狀態(tài)（ -3 到 -6 ）與不同的碰撞能梯度進(jìn)行調(diào)整。產(chǎn)物離子譜在 500 -7000 m /z 范圍內(nèi)進(jìn)行采集，采集率為 1 次掃描 / 秒。負(fù)離子模式的外部校正使用了碘化銫。使用了 MaxEnt™3 軟件進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析前的圖譜去卷積。

LC 條件

LC 體系： 沃特世 ACQUITY UPLC 系統(tǒng)
色譜柱： ACQUITY UPLC OST C 18 1.7 μm ， 2.1 x 50 mm
柱溫： 60 °C
進(jìn)樣量： 5 μL
流速： 0.2 mL/min
流動(dòng)相 A ： 15 mM TEA ， 400 mM HFIP
流動(dòng)相 B ： 50% A ， 50% 甲醇
梯度： 10 分鐘內(nèi) B 液含量從 20-40%

MS 條件

MS 系統(tǒng)： 沃特世 SYNAPT HDMS 系統(tǒng)
毛細(xì)管電壓： 2.7 V
樣品錐孔電壓： 31 V
提取錐孔電壓： 3 V
源溫度： 120 °C
脫溶劑氣溫度： 300 °C
脫溶劑氣流流速： 500 L /h
碰撞阱能量： 6 V
傳輸碰撞能量： 4 V
質(zhì)量分辨率： V 模式下 ~ 9000 （ FWHH ）
LockMass ： CsI 10 mg/mL （水 - 異丙醇， 1 ： 1 ），流速為 5 μL/ 分鐘，掃描時(shí)間 1 秒，頻率 30 秒，設(shè)定質(zhì)量 1685.765 m /z （ Cs 6 I 7 - ）

結(jié)果與討論

碰撞能量模式影響了 MS/MS 碎片產(chǎn)生的程度，能量值須根據(jù)對(duì)應(yīng)分析物進(jìn)行調(diào)整。一般來(lái)說(shuō)，用于 21 核苷酸長(zhǎng)度分析物 MS/MS 碎片化最廣的帶電狀態(tài)是 -5 與 -3 （ 1500 -2000 m /z 范圍內(nèi)）。 25-45 V 的碰撞能梯度對(duì) 21 核苷酸 RNA 產(chǎn)生結(jié)構(gòu)可用的碎片是合適的。

總體上，為獲得 MS/MS 碎片的合理的信噪比（ S/N ），總離子色譜圖（ TIC ）中主成分或污染物須具有最低 500 離子數(shù)的信號(hào)。

互補(bǔ) RNA21 核苷酸鏈分別進(jìn)樣至 UPLC/MS/MS 系統(tǒng)，色譜顯示了較短的寡核苷酸峰（ 5’ 水解產(chǎn)物），它們可以根據(jù)原目標(biāo) 21 核苷酸得到很好的解析（圖 1 ）。成分峰的歸屬是根據(jù)其精確質(zhì)量測(cè)量進(jìn)行的，可確證部分序列。 1

為鑒定全核苷酸結(jié)構(gòu)， 21 核苷酸下游鏈的先導(dǎo)離子 [M-4H] 4- 進(jìn)行了分離與碎裂（圖 2 ）。主要的特征碎片是互補(bǔ)的 c 與 y 離子和 低強(qiáng)度 [a-B] 以及 w 離子（命名見(jiàn)圖 3 ）。上述 5’-P-O 斷裂 序列的離子是 RNA 寡核苷酸 MS/MS 分析的主要碎片，與 DNA 產(chǎn)生的產(chǎn)物（主要是 3’-C-O 斷裂的 [a-B] 與 w 離子） 不同。這是因?yàn)?DNA 分子缺乏 2’- 羥基。 2

雙鏈骨架斷裂產(chǎn)生的內(nèi)部碎片與 c 離子的 胞嘧啶中性缺失（表 1 ）顯著較少，且對(duì)結(jié)構(gòu)鑒定有意義的峰歸屬?zèng)]有貢獻(xiàn)。上游 21 核苷酸 RNA 的 MS/MS 分析，碰撞能梯度（ 30-50 V ）產(chǎn)生的結(jié)果近似（圖 2 ）。

圖 2 21 核苷酸 RNA 寡核苷酸的 MaxEnt3 去卷積 MS/MS 圖譜。星號(hào)為諧波峰（去卷積的結(jié)果）

MS/MS 的 [M-4H] 4- 圖譜中所有的碎片離子中， 21 個(gè)核苷酸的 RNA 通過(guò)幾種電荷狀態(tài)表示（表 1 ）。 MS/MS 圖譜的多電荷離子去卷積通過(guò) MaxEnt 3 軟件進(jìn)行，顯著降低了圖譜復(fù)雜性，簡(jiǎn)化了 MS/MS 數(shù)據(jù)解讀。

去卷積圖譜已足夠用于解讀整個(gè) siRNA 序列（圖 2 ），還檢測(cè)到了幾個(gè)代表了 21 核苷酸分子離子的 A ， G 與 C 氣相核堿基損失的峰。 LockMass 校正后質(zhì)量精確度達(dá)到了 10 ppm 以下，對(duì)手工數(shù)據(jù)解析是很有用的（表 1 ）。三重四級(jí)桿質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率與離子阱儀器可能不能足以進(jìn)行特征碎片歸屬以區(qū)別多電荷峰與其他寡核苷酸復(fù)雜碎片產(chǎn)物。

結(jié)論

開(kāi)發(fā)了通過(guò)精確質(zhì)量 UPLC/MS/MS 進(jìn)行可靠的測(cè)序，以用于 siRNA 寡核苷酸結(jié)構(gòu)確證的方法。

•  SYNAPT HDMS 系統(tǒng)的高質(zhì)量精確性與分辨率可達(dá)到清晰碎片離子歸屬要求。
•  可靠的 MS/MS 方法可產(chǎn)生特征離子碎片，覆蓋了較廣的質(zhì)量范圍，足以用于 21 個(gè)核苷酸的 siRNA 序列的解析。
•  MaxEnt 3 去卷積軟件極大地降低了 MS/MS 圖譜的復(fù)雜性，簡(jiǎn)化了序列解析過(guò)程。

本高效確證性測(cè)序法對(duì)依照美國(guó) FDA 生物藥物化合物規(guī)定測(cè)定藥用寡核苷酸序列十分有用。本法還可能用于計(jì)算機(jī)測(cè)定未知雜質(zhì)序列�？深A(yù)計(jì)，本 MS/MS 方法可用于外切酶難以切斷的化學(xué)修飾寡核苷酸（階梯測(cè)序）。

自動(dòng)化的 MS/MS 可減少數(shù)小時(shí)乃至幾天的分析時(shí)間，降低樣品分析成本。另外， UPLC 還可快速分離目標(biāo) RNA 類(lèi)群，多種寡核苷酸鏈可同時(shí)進(jìn)行 MS 與 MS/MS 分析。 UPLC 分離目標(biāo)寡核苷酸與其被剪切產(chǎn)物的能力對(duì)于 siRNA 代謝研究是十分有利的。

參考文獻(xiàn)

1. UPLC/MS Analysts of Interfering RNA Oligonucleotides. Waterrs Application Note.2008 ： 720002412en.
2. Kirperkar F ， Krogh TN. Rapid Commun 。 Mass Spectrom 。 2001 ； 15 （ 1 ）： 8-14.
3. Adopted from McLuckey SA, et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom 。 1992 ； 3 （ 1 ） 60-70.