實用離心技術(shù)可分為二大類:一類是用于化工、制藥、食品、污水處理、油品處理。工業(yè)的大型制備用離心分離技術(shù),所使用的離心機及其附件屬于大中型工業(yè)生產(chǎn)設(shè)備。其中管式離心機轉(zhuǎn)速較高,小型可達(dá)50,000rpm,較大型(每小時處理量在1.5 噸以 上)也可達(dá)15,000rpm(國外典型機如Sharples,國內(nèi)如上海離心機研究所GQ,GF 系列);轉(zhuǎn)筒式離心機廣泛用于乳品,油品,工業(yè)廢水處理,最大處理量可達(dá)90 噸/小時轉(zhuǎn)速從每分鐘數(shù)千至數(shù)萬轉(zhuǎn)。(國外典型機多為α-Laval,westfalia 等牌號);轉(zhuǎn)鼓式工業(yè)離心機(廣泛用于制藥、食品如Krausmaffai 等);臥式螺旋卸料離心機(最高轉(zhuǎn)速5000rpm,最大處理量10 噸/小時,國外如Westfalia,國內(nèi)如上海離心機研究所的LW 系列);以及轉(zhuǎn)速在3000rpm 以下的三足離心機等等。另一類是用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、農(nóng)業(yè)食品及制藥等試驗室研究、中間試驗、部分生物制藥行業(yè)的小批量生產(chǎn)的實驗離心技術(shù)。目的在分離和純化樣品(特別是生物體組份)并對樣品的某些特性進行分析。后一類離心設(shè)備的轉(zhuǎn)速從每分鐘數(shù)千轉(zhuǎn)到每分鐘十多萬轉(zhuǎn),每次實驗處理的樣品量較少,但其設(shè)備由于轉(zhuǎn)速高(目前最高達(dá) 150000rpm),離心力大(目前已達(dá)1050000×g)對轉(zhuǎn)速、溫度、真空、離心程序、模擬方 法等要求高而使這類離心機構(gòu)造復(fù)雜、并在機械制造、電子電器控制、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、防護設(shè)備、轉(zhuǎn)頭及附件制造等各方面都保持著很高的技術(shù)與工藝水平。實驗離心方法由于樣品的分離要求各不相同以及為適應(yīng)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展而形成了比較完善和具有 一定獨立性的實驗技術(shù)學(xué)科。
實驗離心技術(shù)是一個比較年輕的學(xué)科。最早使用手搖離心機進行食品(比如奶酪生產(chǎn)),血液分離可以追溯到十九世紀(jì);電動低速臺式離心機的商品化始于1912 年;離心技術(shù)的奠 基人在實驗離心技術(shù)方面開拓性的工作創(chuàng)始于1920 年代;而高速、超速離心機的商品化生產(chǎn)、實驗離心技術(shù)的普遍應(yīng)用則是從上世紀(jì)五十年代開始的。 現(xiàn)代工業(yè)的進步,促進了離心設(shè)備的開發(fā),也有利于各種樣品(特別是生物體組份)離心分離方法的迅速推廣和應(yīng)用。而現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的進展和對研究、診斷手段的大量需求而使離心機生產(chǎn)行業(yè)欣欣向榮。二十世紀(jì)70 年代以后,低速、高速、超速離心機產(chǎn)品幾經(jīng)更新 換代。目前,先進的超速離心機已經(jīng)能夠產(chǎn)生相當(dāng)于重力加速度100 多萬倍的離心場并能保 持此離心場連續(xù)運轉(zhuǎn)數(shù)十小時以上;新一代的超速離心機還能對各種生物樣品離心方法進行 模擬,以找到最佳的離心分離方案和進行諸如分子量、沉降系數(shù)的計算。最近幾十年在離心方法方面的研究成果使我們可以利用那些較為先進的離心設(shè)備完成絕大部分生物體組份的 分離和純化。
簡史:
綜觀近年來實驗離心技術(shù)的進步,可把一些重要事件分列如下:
1911~1912 年:開始生產(chǎn)和使用低速(3,000rpm 以下)的商品化臺式離心機。(IEC) 1923~1926 年:瑞典UPPSALA 大學(xué)以Svedberg 為首的科學(xué)家試制了世界上第一臺試驗型超 速離心機,45,000rpm,油透平驅(qū)動,不銹鋼小轉(zhuǎn)頭,轉(zhuǎn)頭置于H2 浴中,1926 年開始運轉(zhuǎn)。
1929 年:Lamn 完成了沉降方程。計算了沉降速度。定義了沉降系數(shù)。
1932 年:細(xì)胞核的離心純化(Behrens)
1933 年:Beams,Pickels 研制成試驗型空氣透平驅(qū)動超速機。
1934 年:Bauer 用以上離心設(shè)備成功分離出黃熱病病毒。 Bensley 等純化了線粒體。
1940 年:Svedberg 與Pederson 出版了“超速離心”一書(文獻(xiàn)(1))概括總結(jié)了在此之前近20 年的研究成果,奠定了離心技術(shù)的理論基礎(chǔ),Svedberg 被公認(rèn)為實驗離心技術(shù)的奠基人,他因這方面的成就而獲得諾貝爾獎。
1940~1950:開始研究用于制備超速離心機的速率——區(qū)帶(Rate-Zonal)密度梯度離心法和用于分析超速離心的沉降速度法。(文獻(xiàn)(2))
1943 年:Pickels 研制成現(xiàn)代固定角式離心轉(zhuǎn)子。(文獻(xiàn)(2))
1951 年:Brakke 第一次發(fā)表了他對速率—區(qū)帶密度梯度離心法的研究成果,并在1960 年再次對這一方法作了綜合評述。(文獻(xiàn)(4))1951 年:Kahler 研制成功甩平(Swing-out)轉(zhuǎn)子。(文獻(xiàn)(5))
1946~1954 年:世界各主要離心機生產(chǎn)廠開始研制并準(zhǔn)備商品化生產(chǎn)離心機。
1955 年以后:開始了超速、高速、低速大容量離心機以及分析用超速離心機的商品化生產(chǎn)。
1957 年:Meselson、
1959 年:Duve 等開發(fā)了等密度離心法。(6)(7)
1964~1966 年:Anderson 等開始建立轉(zhuǎn)子區(qū)帶離心技術(shù)并開發(fā)了低、高、超速區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 (MSE)。在此基礎(chǔ)上,各種轉(zhuǎn)速的連續(xù)流離心分離也逐漸被利用和完善。(8)
1959 年:干涉光學(xué)系統(tǒng)(Richard 等),吸收光學(xué)系統(tǒng)(Nichols,)等方法被用于分析超 離心技術(shù)。(9)(10)
1975 年:垂直管轉(zhuǎn)子被開發(fā)并用于Dupont-Sorvall 油透平驅(qū)動的超速離心機。
1980 年:美籍華人B.H.Chung 等發(fā)表了血清脂蛋白的單次垂直管分離法的研究成果, 被學(xué)術(shù)界及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用至今。(11)
1981 年:美國Beckman 公司開發(fā)的用于細(xì)胞離心純化的“淘洗”轉(zhuǎn)頭(Elutriation rotor)供應(yīng)市場。
1980 年代:由于各種新的分離方法的開發(fā)(如HPLC 等),分析超離心方法及設(shè)備開始 走下坡路。但近年來隨著大分子量(>500,000)樣品研究的需要,分析超離心又有卷 土重來之勢。 1980 年代:在激烈的市場競爭中德國Heraeus 公司及英國MSE 相繼停止了超速離心機 的生產(chǎn)。 1980 年代:為了適應(yīng)大分子利用重金屬鹽等作等密度離心的需要,利用計算機優(yōu)化設(shè) 計的部分轉(zhuǎn)頭對樣品密度的要求(在最高轉(zhuǎn)速時)由1.2g/cm3 提高到1.7 g/cm3
1984 年:由D.Rickwood 等編著的“Centrifugation”一書出版,對離心技術(shù)的各方面作了比較全面的論述。
1992 年:“Centrifugation”再版,增加了制備超速離心的計算機模擬計算并對生物大分 子的最新離心方法作了總結(jié)。(12)
1990 年代:各種離心機開始全面使用變頻電機直接驅(qū)動,超速離心機開始安裝半導(dǎo)體制冷元件。
2001 年:實驗超速離心機最高轉(zhuǎn)速達(dá)到150,000rpm,RCFmax 突破105 萬×g 大關(guān)。 超速離心機開發(fā)了專用模擬軟件并與PC 機聯(lián)用。 近期:日立開發(fā)了無比例保修十年的新型懸掛式驅(qū)動部,各種離心機開始裝用高亮度、大屏幕、多功能液晶顯示屏,超速離心機轉(zhuǎn)頭的壽命自動管理和自動延長系統(tǒng)投入使用。
最主要的離心機制造商:
美國:
·Beckman(現(xiàn)已與Coulter 公司合并為Beckman-Coulter)
·Sorvall(早期為Dupont Sorvall 后獨立為Sorvall 現(xiàn)已與德國Heraens 公司、CARR 公司和Jewett 合并為Kendro,現(xiàn)屬于Thermo-Electrom集團。
·IEC(老廠,以生產(chǎn)中、低檔產(chǎn)品為主)現(xiàn)也屬于Thermo-Electrom集團。
日本:
·HITACHI KOKI(日立工機)
·Kubota(久保田)
·Tomy(精工)
·Kokusan(國產(chǎn))
英國:
·MSE(老牌廠,80 年代后數(shù)年幾近停產(chǎn),1990 年被日本Sanyo 公司收購定牌為Sanyo-MSE,近年來又開始生產(chǎn)離心機)
德國:
·Heraeus(現(xiàn)已與Sorvall 合并為Kendro,現(xiàn)屬于Thermo-Electrom集團)
·eppendorf(臺式機)
·Sigma(小型機為主)
·Hettich(臺式機為主)
·Hermle(小型機為主)
瑞士:
Kontron(目前已從中國市場隱退)
法國:
Jouan(高速以下,現(xiàn)屬于Thermo-Electrom集團)
目前國際市場上最先進的機型:
·超速離心機
(美)Beckman-Coulter Optima XL-A,XL-I 分析超速機型 Optima L 系列(經(jīng)濟型): L-100K,L-90K,LE-80K,(老型號,1989年推出)Optima-MAX(臺式) Nmax= 130,000rpm, RCFmax=1,019,000xgOptima-L-XP 系列 L-100XP,L-80XP
(日)Hitachi Koki CP-100WX,Nmax=10 萬rpm, RCFmax>800,000xg ,CP-90WX,CP-80WX(有與計算機聯(lián)用的模擬軟件, 在轉(zhuǎn)頭上自動記錄離心數(shù)據(jù),轉(zhuǎn)頭壽命自動管理),CP70MX,70,000rpm CS150GXL,CS120GXL,Nmax=15 萬rpm (小型機,目前世界上轉(zhuǎn)速最高,離心力最大RCFmax=1050,000xg)
(美國)Sorvall Ultra WX100,90,80(主機由日本Htiachi生產(chǎn)) Nmax=10 萬rpm, RCFmax>800,000xg
·高速離心機
(日)Hitachi Koki CR-GII 系列(22,21)
(美)Thermo-Sorvall RC-6Plus(主機由日本Htiachi生產(chǎn))
(美)Beckman-Coulter Avanti-J 系列
(法)Jouan KR22i(Thermo集團)
·低速大容量離心機:
(德)Thermo-Heraeus Cryofuge 6000i
(日)Hitachi Koki CR-7 系列
(美)Thermo-Sorvall RC-3BP,RC-12BP,RC-3C plus
(美)Beckman-Coulter J6 系列
(美)Thermo-IEC PR-7000M(直流電機,有碳刷)
(法)Thermo-Jouan KR4i
·小型高速離心機
(德)Thermo-Heraeus Biofuge Stratos、Primo/Primo R、LEGEND T/RT、MACH 1.6/1.6R、Labofuge 200/300/400/400 R、MULTIFUGE 4KR
(日)Hitachi Koki CF-RX 系列,CF-RXII 系列
(美)Beckman-Coulter Allegra 系列
(德)Sigma,2K 系列、3K 、4K、6K系列
(德)Hettich Universal 系列、EBA 系列、Rotina 系列
(德)Hermle Z-233MK-2/MK-2、Z323/323K、Z383/Z383K、Z513/513K、Z36HK、Z366160M、300/300K等等
(美)Thermo-Sorvall T-21
(德)eppendorf 5415、5417、5804、5810、5818、5824等等
(美)Thermo-IEC Multi-RF (法)Thermo-Jouan MR 系列、BR 系列
實驗離心機技術(shù)新進展:
設(shè)備:
近二十年離心機的轉(zhuǎn)速、離心力加速度、容量、使用壽命,都有了很大提高,在驅(qū)動器、轉(zhuǎn)頭、電子、電器空控制、制冷系統(tǒng)、整機配置及附件等各方面都有了長足進步。至今,我們可以說,對于已知或未知的生物體組份,用實驗離心設(shè)備進行分離純化已經(jīng)沒有太多困難,F(xiàn)代離心設(shè)備除了直接按照使用者要求(轉(zhuǎn)速、時間、溫度、程序、轉(zhuǎn)頭等)進行離心實驗外,還可以對各種樣品的離心分離在離心前就離心條件進行探索和優(yōu)化。 驅(qū)動部:有串激(或復(fù)激)直流有碳刷電機直接或間接(齒輪或皮帶增減速)驅(qū)動演變?yōu)槿缃竦淖冾l電機直接驅(qū)動。
變頻電機直接驅(qū)動的優(yōu)點是:在各種不同轉(zhuǎn)速都能輸出最大扭距(這樣就開發(fā)了如今的 很多種高-低速兼用型號,如一機多用提供了有效的驅(qū)動方式);維護和日常維修周期延長。原來的串激直流電機碳刷壽命一般在102~103 小時,碳刷的頻繁更換及整流器的加工給用戶 造成很多不便。使用變頻電機后,驅(qū)動部的維護周期對高速離心機來說提高到3000~5000 小時以上(軸承更換)而對沒有制冷設(shè)備的低速離心機和用油潤滑的超速離心機,驅(qū)動部的 免維護周期可提高到十年以上;降低了運轉(zhuǎn)噪聲。免除了碳刷與整流器摩擦產(chǎn)生的高頻噪聲。實現(xiàn)了室內(nèi)安靜運轉(zhuǎn)。(如HITACHI CS-150GX 超速機在150,000rpm 運轉(zhuǎn)時噪聲指標(biāo)為 48dbA 以下);實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)速、加減速速率的數(shù)字化計算機控制,達(dá)到了很高的控制精度(如 100,000rpm 以下運轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速控制精度達(dá)到±10rpm);免除了碳粉污染,使得這類離心機可以進入無菌、無塵實驗室,這對某些生物樣品(如注射用藥、疫苗、生物制品)及血液(血庫、血站、血液中心)和醫(yī)學(xué)研究的離心分離尤其重要;此外,同等功率的變頻電機重量輕、體積小,便于裝卸和修理;電機本身結(jié)構(gòu)簡單(和一般感應(yīng)電機一樣)成本較低。驅(qū)動部減震功能的改進使驅(qū)動部壽命增加,使肉眼觀測液面水平而不用天平的常規(guī)離心操作 成為可能。
轉(zhuǎn)頭:
突出的改進表現(xiàn)在經(jīng)計算機計算優(yōu)化后的輕型轉(zhuǎn)頭;碳纖維材料制造的超速和大容量超輕轉(zhuǎn)頭;適用于生物大分子(DNA,RNA,蛋白等)離心分離用的小傾角轉(zhuǎn)頭(固定傾角 7°~10°);超高速,特大離心力轉(zhuǎn)頭等等。制冷系統(tǒng):
離心方法新進展:
·實驗離心技術(shù)的數(shù)學(xué)計算:(包括沉降方程的建立,Svedberg 方程的建立,離心加速 度、沉降速度、沉降時間、沉降系數(shù)、分子量、擴散系數(shù)、微分比容、液體動壓力轉(zhuǎn)子K 系數(shù)Pi 系數(shù)等等)在70 年代以前已經(jīng)建立;而離心方法(差分離心法、速率-區(qū)帶密度梯 度離心法,等密度離心法以及分析超離心的沉降速度法、沉降平衡法-包括紋影光學(xué)系統(tǒng)、干涉光學(xué)系統(tǒng),吸收掃描光學(xué)系統(tǒng)等等)則在更早些時候就已經(jīng)得到充分的研究。其中一些 簡單的運算已被廣大實驗人員熟練地運用。但涉及分子量、沉降系數(shù)、沉降速度、擴散系數(shù)等較為繁復(fù)的運算工作,只有極少數(shù)研究人員在用。微機在離心機上的應(yīng)用以及PC 機的普 及從八十年代開始開發(fā)沉降平衡法及沉降速度法的計算機模擬,利用制備超速離心機和離心 技術(shù)的數(shù)學(xué)分析來探知生物樣品的沉降過程。在已知某些參考條件下計算S,M,D 等重要 參數(shù)。尤其是前者,對某些樣品的離心結(jié)果知之甚少的情況下,預(yù)先利用離心分離軟件來優(yōu)化選擇離心參數(shù)有很高使用價值。值得注意的是某些離心機還專門為與PC 機聯(lián)用開發(fā)了模 擬軟件,既降低了離心主機的價格,又?jǐn)U展了模擬計算范圍,收到了很好的效果。
·某些特定樣品離心方法的研究和推廣。如:質(zhì)粒DNA 分離:用小角度轉(zhuǎn)頭,CSCL 加E.B.和Triton-x-100 的自形成梯度平衡等密度離心法(文獻(xiàn)12,13) ;血清脂蛋白的離心分離:包括單次垂直管離心法等等((11),(14)) ; 超高速、小容量的生物大分子快速離心分離法(文獻(xiàn)12)等等。
1) Svedberg,T. Pederson, K.“The Ultracentrifugation”OxfordUniversity press.(1940)
2) Pickels,E.G. J.Gen.Phys. 26, PP341~360 1943
3) Pickel,E.G. “Centrifugation inBiophysical Research Methods” Interscience,New York (1950)
4) Brakke,M.K. Adran.Virus.Res. Vol.7 193~224 (1960)
5) Kahler,M. J.Phys. Colloid Chem.55,1344-1350(1951)
6) Meselson,M 等 Proc.Nat.Acad.Sci. U.S. 43,581~588,(1957)
7) De Duve ,C.J. Cell Biol.Vol.50,No.1, 20~25(1959)
8) Anderson,N.G. Anal.Biochem. 31,255;32,460(1969)
9) Rechard, E.G. J.Phy.Chem. 63,1578(1959)
10) Nichols,J.B. “Physical Methods of Organic Chemistry” 3rd ed. Pt.II, Interscience press.New York (1959)
11) B.H. Chung etc. J.Lip.Res. Vol:21 PP284~291 (1980)
12) D.Rickwood,B.D. Hames, “Preparative Centrifugation- A Practical Approach ” OxfordUniversity Press (1922)
13) 余興明 “質(zhì)粒DNA 的超速離心分離” 生命的化學(xué),1994.1
14) 余興明 “血清脂蛋白的離心分離技術(shù)” 生命的化學(xué),1997.3
15)余興明 “離心技術(shù)講座”(有21篇文章和大量的分離實例)2005-2006