高通量、低成本 SNP、突變或甲基化檢測(cè)方法
——HRM技術(shù)應(yīng)用

HRM介紹

    HRM技術(shù)是 high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲線分析技術(shù)，是近年國(guó)外興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。基于高效穩(wěn)健的 PCR技術(shù)，HRM不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在 PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品突變、單核苷酸多態(tài)性 -SNP、甲基化、 HLA配型等的分析。

    因操作簡(jiǎn)便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作， HRM技術(shù)受到普遍關(guān)注。

HRM原理

    HRM的主要原理是根據(jù) DNA序列的長(zhǎng)度， GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。隨著高精度 PCR儀（ LightCycler® 480和 Rotor-Gene 6000）和飽和染料（ LC Green、 Eva Green等）的出現(xiàn)，HRM技術(shù)的普及使用成為可能。 
 
HRM應(yīng)用

SNP（單核苷酸多態(tài)性）的篩查。

 基因突變掃描，包括缺失、重復(fù)、點(diǎn)突變。

 新突變的篩查。

 甲基化的篩查。

    遺傳育種中特定突變的篩查、未知突變的發(fā)現(xiàn)。

 HLA基因組配型、等位基因頻率分析、物種鑒定、品種鑒定、甲基化研究。

 法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定。

 動(dòng)植物品質(zhì)相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的研究等。植物抗逆性，突變與性狀關(guān)聯(lián)性研究。

HRM特點(diǎn)

 高通量：1次可同時(shí)檢測(cè) 10-384樣本，適合大樣本、多 SNP、多突變位點(diǎn)及多位點(diǎn)甲基化的掃描。

 高敏度：腫瘤研究中低突變率樣品基因突變檢測(cè)，最低檢測(cè)到 0.1%的突變樣品基因突變，即檢測(cè)到 1000個(gè)正常細(xì)胞中 1個(gè)突變細(xì)胞，適用于手術(shù)和其它微量組織中突變檢測(cè)。檢測(cè)靈敏性遠(yuǎn)高于“ PCR+測(cè)序”的 25%，即 100個(gè)正常細(xì)胞中至少有 25個(gè)突變細(xì)胞，測(cè)序僅適用手術(shù)組織。

 特異性好：PCR產(chǎn)物無需后續(xù)處理，特異性高達(dá) 100%。直接未知雜合突變鑒定準(zhǔn)確性 100%，特異性 100%。直接未知純合突變鑒定準(zhǔn)確性 96%，利用非標(biāo)記探針快速基因分型法直接未知純合子鑒定準(zhǔn)確性 100%。

 重復(fù)性好：重復(fù)性 100%

 使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限，除可檢出已知突變外，也能檢測(cè)出未知突變。

 重復(fù)性好：樣品 PCR和 HRM分析直接在同一管內(nèi)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)閉管操作，避免交叉污染。

 操作簡(jiǎn)便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無需序列特異性探針，無需測(cè)序，也不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限。

 成本低：簡(jiǎn)化操作時(shí)間和步驟，大大降低成本，檢測(cè)費(fèi)用遠(yuǎn)少于測(cè)序、 Taqman探針技術(shù)。

 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。傳統(tǒng) PCR+測(cè)序”方法難以檢測(cè)大部分不能手術(shù)的患者。

 其它：只檢測(cè) PCR樣品中熒光強(qiáng)度的變化，不消耗任何 PCR樣品，無污染， PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行下游分析，非常適合于測(cè)序前的 SNP、甲基化等預(yù)掃描篩查。

HRM應(yīng)用舉例

SNP檢測(cè)

    單核苷酸多態(tài)性（ Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指單個(gè)核苷酸堿基的改變，包括置換、顛換、缺失和插入，導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，這就是 SNP。SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認(rèn)為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記。

    HRM檢測(cè) SNP技術(shù)是依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)將 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性，期間實(shí)時(shí)檢測(cè)體系內(nèi)熒光信號(hào)。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段 DNA都有其獨(dú)特的序列，因而也就有了獨(dú)特的熔解曲線形狀，如同 DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子（下圖）。

    檢測(cè) SNP的方法有很多種。成本較低、通量較大的方法大都局限于已知、特定位點(diǎn)，如 Taqman探針法。既要對(duì)已知位點(diǎn)分析又要查找未知位點(diǎn)，一般采用 PCR+測(cè)序的方法，成本高、操作繁復(fù)較低。

    HRM技術(shù)是一種低成本、高通量、快速，且不受位點(diǎn)局限的檢測(cè)方法，是 SNP篩查的最佳選擇。  

甲基化檢測(cè)

    DNA甲基化是 D NA堿基序列 C pG島上常發(fā)生的一種共價(jià)修飾，使基因表達(dá)受抑制，可以遺傳。在腫瘤等病理組織中，特異基因的特征性甲基化狀態(tài)可以作為早期診斷的重要標(biāo)志物。甲基化檢測(cè)包括特異性 P CR、Northern印跡法、芯片等，測(cè)序是金標(biāo)準(zhǔn)，但這些方法低通量、成本高、花費(fèi)大量時(shí)間且難以標(biāo)準(zhǔn)化。
    高分辨率熔解（H igh ResolutionMelt,HRM）是一種最新的在表觀遺傳學(xué)中檢測(cè) C pG位點(diǎn)的一種新技術(shù)，可區(qū)別單個(gè)堿基的甲基化差異（下圖）。 

    HRM檢測(cè)甲基化的方法具有高通量、操作簡(jiǎn)單、靈敏高、重復(fù)性高、成本低、不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限高度等優(yōu)勢(shì)，將對(duì)于遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的研究和臨床應(yīng)用提供更大的幫助。

突變篩查

    HRM的特點(diǎn)是高特異性和高靈敏度，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到 1%-0.1%。在大量樣本、多個(gè)突變位點(diǎn)的篩查上，比傳統(tǒng)的非均一性方法（如 dHPLC）更方便、性價(jià)比更高，因?yàn)楹笳咝枰獙�擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一臺(tái)儀器上進(jìn)行突變分析。

    HRM可對(duì)任何擴(kuò)增子上的未知突變進(jìn)行篩查，不需要識(shí)別不同等位形式的引物或探針，不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，既可以對(duì)未知突變進(jìn)行篩查、掃描，又可以對(duì)已知突變進(jìn)行分析。所以，相比定量探針法的突變分析和其它類型的快速突變分析法，應(yīng)用面大大拓展，成本也大大降低，成為近年來國(guó)外新興的遺傳學(xué)、方法學(xué)研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。 

圖：HRM分析 219bp的人類 MBL-2基因片段（384個(gè)樣本），結(jié)果顯示了四種主要的基因類型（藍(lán)色、紅色、綠色和橄欖綠色）和兩個(gè)少數(shù)樣本的基因型（橙色和紅紫色）。

其它應(yīng)用
植物和動(dòng)物品質(zhì)和育種中基因型鑒定：HRM方法快速而有效的解決如何確定親本的基因型是否相同、有否新型性狀的遺傳突變等問題。
HLA基因組配型：器官移植的 HLA配型、同胞之間 HLA基因型確定，應(yīng)用舉例：快速確定 HLA高度多態(tài)性位點(diǎn)的類型，及非親源關(guān)系個(gè)體間異源造血干細(xì)胞移植前的 HLA基因型確認(rèn)。
等位基因頻率分析：SNP頻率分析等。
物種鑒定、品種鑒定：微生物品種、物種快速鑒定；動(dòng)植物品種鑒定。應(yīng)用舉例：臨床細(xì)菌的鑒定。對(duì)臨床細(xì)菌的培養(yǎng)物進(jìn)行 16SrRNA的實(shí)時(shí)擴(kuò)增，并進(jìn)行 HRM分析，每個(gè)菌種的熔解曲線模式就如果該物種的分子指紋，從而可以根據(jù) HRM的不同對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。
法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定：檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性 SNP鑒定，插入 /缺失多態(tài)性 DIP鑒定等。應(yīng)用舉例：將 HRM用于法醫(yī)學(xué) SNP、DIP鑒定，協(xié)助犯罪鑒定，親子鑒定。相對(duì)于傳統(tǒng)鑒定方法，HRM是一種簡(jiǎn)單、便宜、高通量的二等位基因分子標(biāo)記鑒定的方法。

樣品處理：

 組織標(biāo)本：取新鮮組織塊 50mg，一種用液氮或干冰保存、運(yùn)輸，另外可放入裝有含 RNAlater凍存管（本公司提供），4℃低溫保存并常規(guī)冰袋運(yùn)輸。

 穿刺或者活檢標(biāo)本：處理方式同上。

 酒精固定標(biāo)本：對(duì)于不能送檢新鮮標(biāo)本的送檢者，請(qǐng)將標(biāo)本從手術(shù)臺(tái)上取下后，立即切取腫瘤標(biāo)本（≥5mm3），放于容器內(nèi)（如帶蓋的塑料瓶），采用 75％的乙醇立刻固定，保證酒精的體積是標(biāo)本的 5倍左右。

 石蠟包埋組織切片：要求提供 10張組織切片（面積 >10 mm×10 mm，厚度約 5－10μm），載玻片片盒保存、常溫運(yùn)輸。如果組織太小，請(qǐng)酌情增加送檢樣品數(shù)量。

 血液樣本：取 5ml抗凝血，獲得血漿，常規(guī)冰袋 4℃低溫運(yùn)輸。

 胸腹水：腫瘤胸腹水離心后加 75%的酒精 1 ml。

 糞便：收集 10g糞便，用柱式離心的方法收集基因組 DNA。

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