【摘要】
目的：探討ATP發(fā)光技術(shù)快速檢測菌落總數(shù)的可行性。方法比較ATP生物發(fā)光值與平板計數(shù)法對細菌總數(shù)進行檢測。
結(jié)果：檢測結(jié)果相關(guān)性研究分析表明，兩者在一定范圍內(nèi)具有顯著相關(guān)性。
結(jié)論：ATP生物發(fā)光法操作簡便，應(yīng)用范圍廣，可應(yīng)用于對食品中菌落總數(shù)的快速檢測。

 

 

菌落總數(shù)是食品微生物國標檢測中的一個重要指標，主要是作為判定食品被細菌污染程度的標志。在國家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標準和進口貿(mào)易中許多食品的衛(wèi)生指標都有菌落總數(shù)的限量規(guī)定。常規(guī)的菌落總數(shù)檢驗方法(平板計數(shù)法)存在操作繁瑣、測試周期較長及檢測結(jié)果在實際生產(chǎn)的質(zhì)量控制中意義不大等問題。ATP生物發(fā)光測定法是快速檢測微生物的方法之一。本文對ATP生物發(fā)光測定法與平板計數(shù)法的相關(guān)性進行了研究分析，并對ATP生物發(fā)光測定法進行衛(wèi)生學(xué)檢測的可行性和可操作性進行探討。

 

1．1儀器與試劑
ATP生物發(fā)光快速檢測系統(tǒng)配套儀器及試劑(沈陽中科靚馬生物工程有限公司生產(chǎn))，包括：濱松9505微量光度計、專用比色杯、發(fā)光反應(yīng)試劑(LLR)、細菌細胞ATP釋放試劑(XRA)。旋渦混合器。稀釋用磷酸鹽緩沖液(PBS)9ml試管分裝10管(121℃高溫高壓滅菌)。固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(121℃高溫高壓滅菌)。PE手套。大腸桿菌(ATCC25922—3，購于中國藥品與生物制品檢定所)。恒溫搖床。臺式離心機。

 

1．2．1實驗準備
計數(shù)前1天，用接種環(huán)刮取大腸桿菌斜面培養(yǎng)物一環(huán)接種到裝有40mlLB的100ml三角瓶內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取上述培養(yǎng)物離心(10000r／min，1min)倒去上清液，沉淀用等體積PBS洗滌1次，用同樣體積PBS懸浮，此即培養(yǎng)物原液。稀釋：(假定培養(yǎng)物濃度約為1×10⁶ cell／m1)用PBS將培養(yǎng)物做10倍遞增稀釋。

 

1．2．2平板計數(shù)
確定3個用于平皿計數(shù)的稀釋梯度，保證至少1個梯度的計數(shù)在30～300范圍內(nèi)，吸取1ml加人到玻璃滅菌空培養(yǎng)皿中，每個梯度平行倒兩個平板，同時做空白對照。于37℃溫箱培養(yǎng)48h計數(shù)。選擇菌落計數(shù)在30～300范圍內(nèi)均勻分散的釋梯度作平板計數(shù)并取其平均值。

 

1．2．3 ATP測光
提前打開微量光度計屏幕顯示RLU為“0”，用滅菌的移液管尖吸取50待測菌液，加入專用比色杯中。將比色杯放人微量光度計抽屜，手持XRA試劑瓶，向比色杯底垂直滴加兩滿滴XRA。用滅菌的100µl移液管尖，將50µl LLR加入杯中，和緩地吸擠3次，混勻反應(yīng)液。保持抽吸時間、次數(shù)一致。并力求所有樣品的這段操作時間一致。關(guān)上微量光度計抽屜，此時微量光度計自動進行熒光值測量，等微量光度計顯示出熒光值后記錄熒光值的大小。

 

2．1 ATP測定法與平板計數(shù)法試驗結(jié)果
兩種方法測定細菌總數(shù)的兩次平行試驗結(jié)果見表1、表2。

2．2 ATP測定法與平板計數(shù)法相關(guān)性
依據(jù)表1、表2數(shù)據(jù)，以光值平均數(shù)的對數(shù)值為Y軸，平板計數(shù)平均數(shù)對數(shù)值為x軸，作x、Y散點圖描繪關(guān)系曲線，Y=0.8834x—1.6807，R²=0．9778。從數(shù)據(jù)和散點可以看出，第一次試驗的1O一、第二次試驗的10^-5、10 ^-6 3個梯度的值與其他值線性較差，在檢測限以外。可以看出，在細菌數(shù)量10 cfu／ml以上范圍內(nèi)平板計數(shù)與生物發(fā)光值成顯著相關(guān)。

 

ATP生物發(fā)光法檢測靈敏度高，試驗中發(fā)現(xiàn)受試液顏色、操作及非細菌ATP對發(fā)光強度均有影響，但對總體發(fā)光強度的影響都<0．9％。從待測樣品的制備到細菌ATP的提取，直到ATP發(fā)光強度的檢測，整個過程可在lh內(nèi)完成，具有快速、簡便的特點，可以滿足一般快速檢測的要求。ATP發(fā)光技術(shù)能達到的檢測極限為l0^-15 molATP，相應(yīng)的細菌總數(shù)應(yīng)在10³ cfu／ml以上，樣品衛(wèi)生指標標準在10³ cfu／ml以上的可即時得出樣品細菌總數(shù)數(shù)量判斷質(zhì)量好壞。而微生物檢驗衛(wèi)生指標在10³ cfu／ml以下，可采用適當簡便的富集技術(shù)，使樣品菌落總數(shù)達到有效檢測范圍，而該技術(shù)也是ATP發(fā)光技術(shù)能應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗的關(guān)鍵。近年來，蟲熒光素酶已通過基因工程生產(chǎn)，價格大幅度減低，隨著相關(guān)儀器的小型化，ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會在國內(nèi)相關(guān)行業(yè)得到迅速普及。

（馬妮 趙虹 中國衛(wèi)生工程學(xué)）