多肽抗生素研究進(jìn)展
孫超　王暉　孫波　彭學(xué)賢

摘要　多肽抗生素是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，一般具有抗細(xì)菌或真菌的作用，有些還具有抗原蟲(chóng)、病毒或癌細(xì)胞的功能。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，多肽抗生素可分為5類：①具有螺旋結(jié)構(gòu)的線性多肽；②富含某種氨基酸的線性多肽；③含有一個(gè)二硫鍵的多肽；④含有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵的多肽；⑤羊毛硫抗生素。根據(jù)作用機(jī)理的不同，多肽抗生素又可分為裂解細(xì)胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已經(jīng)開(kāi)始用于醫(yī)藥、食品和植物抗病基因工程等方面，并且有著很大的發(fā)展?jié)摿Α?BR>
多肽抗生素是指相對(duì)分子質(zhì)量通常在1×104以下，具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)。但是由于區(qū)分小肽與蛋白質(zhì)的界限不很嚴(yán)格，不同學(xué)者對(duì)多肽抗生素的分子量上限有不同的觀點(diǎn)。最初，人們把這類具有抗菌活性的多肽稱為“antibacterial peptides”，中文譯為“抗菌肽”，其原意應(yīng)為“抗細(xì)菌肽”。后來(lái)發(fā)現(xiàn)有些“抗細(xì)菌肽”還具有抗真菌等其它微生物的功能，便稱之為“antimicrobial peptides”。但是隨著研究的深入，人們相繼發(fā)現(xiàn)這類多肽還具有抗寄生蟲(chóng)、病毒、癌細(xì)胞等功能，尤其是隨著這類多肽物質(zhì)在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用，許多學(xué)者傾向于稱之為“peptide antibiotics”――“多肽抗生素”。也許是由于幾乎所有的多肽抗生素都具有抗細(xì)菌的功能，“抗菌肽”作為一個(gè)約定俗成的名稱，在國(guó)內(nèi)依然被廣泛采用。如果沒(méi)有特殊說(shuō)明，本文中的多肽抗生素特指由基因編碼，在核糖體上合成的多肽抗生素。那些在代謝過(guò)程中通過(guò)酶促反應(yīng)合成的多肽性質(zhì)的

多肽抗生素研究的真正興起是從20世紀(jì)80年代初開(kāi)始的。1980年，Boman等人從美國(guó)天蠶蛹中分離得到了具有抗菌活性的多肽――cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列。同是在1980年，Lefur等人從兔的巨噬細(xì)胞中分離到了另一種多肽抗生素――defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后數(shù)年間，人們相繼從細(xì)菌、真菌，到兩棲類、昆蟲(chóng)、高等植物、哺乳動(dòng)物、直至人類體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了多肽抗生素。目前，僅昆蟲(chóng)來(lái)源的多肽抗生素，就已達(dá)170余種。為了研究的方便，人們根據(jù)多肽抗生素的結(jié)構(gòu)對(duì)它們進(jìn)行了分類。

1　多肽抗生素的分類

1.1　具有螺旋結(jié)構(gòu)的線性多肽　cecropins是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物多肽抗生素，1980年，由Boman等從美國(guó)天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37～39個(gè)氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的C端被酰胺化，酰胺化對(duì)其抗菌活性具有重要作用。此后，人們相繼從家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅中分離到了cecropins類多肽抗生素。1989年，Lee等人從豬小腸中分離到了cecropin P1，說(shuō)明了cecropins可能在動(dòng)物中廣泛存在。cecropins對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌都具有很強(qiáng)的殺傷力，而對(duì)真菌和真核細(xì)胞沒(méi)有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。
magainins也是較早發(fā)現(xiàn)的一類具有雙親螺旋結(jié)構(gòu)的多肽抗生素。最初是從蟾蜍的皮膚中分離得到的,后來(lái)在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織和腸組織中發(fā)現(xiàn)了其類似物。magainins對(duì)革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌、真菌、原生動(dòng)物都有殺傷作用，但是對(duì)革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右。

此外，從一些動(dòng)物的再生性器官和兩棲類的多種組織器官中分離得到了一些具有螺旋結(jié)構(gòu)的多肽，如來(lái)源于南美蛙的dermaseptin和來(lái)源于樹(shù)蛙的bombininh。

1.2　富含某種氨基酸的線性多肽　apidaecins是從蜜蜂中分離得到的富含脯氨酸的多肽抗生素，一般含有16～18個(gè)氨基酸殘基，其中脯氨酸含量高達(dá)33％，精氨酸含量可達(dá)17％。其一級(jí)結(jié)構(gòu)中具有PRP和PP的典型motifs。apidaecins對(duì)某些革蘭陰性菌具有很強(qiáng)的活性，而對(duì)革蘭陽(yáng)性菌不起作用。apidaecins對(duì)某些革蘭陰性的植物病原菌和腸桿菌科的致病菌的高殺傷力，使其在植物抗細(xì)菌病基因工程和食品工業(yè)中有著很好的應(yīng)用前景。

drosocin是來(lái)源于果蠅的一種富含脯氨酸的多肽抗生素，在結(jié)構(gòu)上與apidaecin具有一定的相似性，但是在其11位的蘇氨酸羥基上連接著一個(gè)O-二糖鏈(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖)。

coleoptericin和hemiptericin分別來(lái)源于鞘翅目和半翅目昆蟲(chóng)，一級(jí)結(jié)構(gòu)中富含甘氨酸，分子量一般較大。Oppenheim等人從人的腮腺和下頜腺分泌物中分離得到了一組富含組氨酸的多肽抗生素，長(zhǎng)度在7～38個(gè)氨基酸殘基不等，被稱為histatins。對(duì)于引起口腔感染的多種微生物具有活性。indolicidin是來(lái)源于牛中性粒細(xì)胞的多肽抗生素，因其13個(gè)氨基酸中含有5個(gè)色氨酸而得名。其C端是酰胺化的。對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強(qiáng)的殺菌活性。

1.3　含有一個(gè)二硫鍵的多肽　這是一類數(shù)量很少的多肽抗生素，第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的這類多肽是bactenecin，來(lái)源于牛中性粒細(xì)胞［5］。其12個(gè)氨基酸中含有4個(gè)精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵。bactenecin對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有活性。

這類多肽中還包括一些來(lái)源于蛙類皮膚的多肽抗生素，一般在C端有一個(gè)由7個(gè)氨基酸形成的“l(fā)oop”和一個(gè)長(zhǎng)的N端“尾巴”，如brevinin-1，brevinin-2。

1.4　含有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵的多肽　這類多肽的典型代表是defensins，最初發(fā)現(xiàn)的α-defensins來(lái)源于哺乳動(dòng)物的組織中，一般含有29～34個(gè)氨基酸殘基，其中6個(gè)保守的半胱氨酸形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α-defensins可形成3層的β片層結(jié)構(gòu)，通過(guò)3個(gè)二硫鍵和Arg-6與Glu-24之間的鹽橋而被穩(wěn)定。目前，defensins已被合成并已商品化。defensins對(duì)多種細(xì)菌和某些真菌具有殺傷作用，并且對(duì)真核細(xì)胞有一定的毒性。defensins對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的活性比革蘭陰性菌強(qiáng)。defensins的活性比cecropins弱，并且通常在低離子強(qiáng)度下起作用。

β-defensins比α-defensins大一些，一般含有38～42個(gè)氨基酸殘基。都含有3個(gè)二硫鍵和4～8個(gè)精氨酸。

昆蟲(chóng)defensins在C末端與α-defensins相似，但是只有兩個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，中間有一段α螺旋起穩(wěn)定作用。主要對(duì)革蘭陽(yáng)性菌起作用，而對(duì)真菌沒(méi)有作用。

植物defensins一般有45～54個(gè)氨基酸殘基，可形成4個(gè)二硫鍵，3個(gè)β片層結(jié)構(gòu)和一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。植物defensins一般只對(duì)真菌起作用而對(duì)細(xì)菌沒(méi)有作用。不同植物defensins對(duì)真菌的抗菌譜不同。

thionins也是一類來(lái)源于植物的多肽抗生素，含有45～47個(gè)氨基酸殘基，有6個(gè)或8個(gè)半胱氨酸形成的3個(gè)或4個(gè)二硫鍵。其二級(jí)結(jié)構(gòu)可形成2個(gè)反平行的α螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)反平行的β片層結(jié)構(gòu)。thionins抑制多種植物致病細(xì)菌和真菌，但是對(duì)假單孢菌屬和歐文氏菌屬的細(xì)菌不起作用。
1.5　羊毛硫抗生素　羊毛硫抗生素(lantibiotics)是指一些由細(xì)菌產(chǎn)生的，由基因編碼，在核糖體中合成，經(jīng)翻譯后加工而含有一些特殊有機(jī)基團(tuán)的多肽抗生素。其中研究最廣泛的是nisin。它是來(lái)源于乳酸菌的一種多肽抗生素，成熟多肽由34個(gè)氨基酸組成，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基團(tuán)。主要對(duì)革蘭陽(yáng)性菌起作用，而對(duì)革蘭陰性菌不起作用。已被廣泛應(yīng)用作食品保鮮劑。nisin及其類似物在醫(yī)藥上的應(yīng)用研究也正在進(jìn)行。

2　多肽抗生素的生物學(xué)活性

2.1　多肽抗生素對(duì)細(xì)菌的殺傷作用　大多數(shù)多肽抗生素都具有抗細(xì)菌的作用。目前認(rèn)為cecropins、magainins、defensins等許多可形成雙親螺旋結(jié)構(gòu)的多肽抗生素是通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，在膜上形成離子通道，引起胞內(nèi)物質(zhì)的外漏而殺死細(xì)菌的。通過(guò)對(duì)sarcotoxinIA的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在脂質(zhì)體中存在膽固醇時(shí)，sarcotoxinIA對(duì)其的裂解作用減弱。這可部分解釋這類多肽對(duì)真核細(xì)胞不起作用的原因。

apidaecins類多肽抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制是非裂解機(jī)制，可能是通過(guò)與膜上的手性分子相互作用進(jìn)而殺死細(xì)菌的。

2.2　多肽抗生素對(duì)真菌的殺傷作用　許多多肽抗生素除了具有抗細(xì)菌的活性外，還具有抗真菌的作用。如來(lái)源于蛙類的PGQ，dermaseptin和哺乳動(dòng)物的defensins對(duì)一些人類致病真菌具有殺傷作用，其中兔defensinNP-1對(duì)玉米的致病真菌也有作用。一些來(lái)源于植物的多肽抗生素，如植物defensins、thionins等對(duì)多種植物致病真菌具有殺傷作用。最近，Cavallarin等發(fā)現(xiàn)cecropin衍生物N末端α螺旋區(qū)域的11個(gè)氨基酸順序與抗真菌活力有關(guān)。

2.3　多肽抗生素對(duì)原蟲(chóng)的作用　一些多肽抗生素可以有效地殺滅寄生于人類或動(dòng)物的寄生蟲(chóng)。如Shiva-I(一種cecropin的類似物)可以殺死瘧原蟲(chóng)；一種cecropin/melittin的雜合肽可以殺傷萊什曼鞭毛蟲(chóng)。

2.4　多肽抗生素對(duì)病毒的作用　目前發(fā)現(xiàn)多肽抗生素可以3種不同的機(jī)制起到抗病毒的作用。第1種是通過(guò)多肽抗生素直接與病毒粒子相結(jié)合而發(fā)揮作用。如α-defensins，modelin-1等對(duì)皰疹病毒的作用，polyphemusins對(duì)HIV病毒的作用。第2種是抑制病毒的繁殖，如mellitin和cecropin A 對(duì)HIV病毒的作用。第3種機(jī)制是通過(guò)模仿病毒的侵染過(guò)程而起作用。如melititn及其類似物K7I的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒核衣殼與mRNA相互作用的區(qū)域具有相似性，通過(guò)干擾病毒的組裝而對(duì)病毒產(chǎn)生作用。

2.5　多肽抗生素對(duì)癌細(xì)胞的作用　許多研究顯示與正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞對(duì)多肽抗生素更敏感，目前對(duì)引起這種差別的原因還不完全清楚，初步認(rèn)為與以下幾個(gè)因素有關(guān)：①由于腫瘤細(xì)胞的高代謝引起細(xì)胞膜電位的改變；②腫瘤細(xì)胞膜外表面含有更高的酸性磷脂；③腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架或胞外基質(zhì)的變化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cecropin及其類似物，magainin2及其類似物，cecropinA-magainin2, cecropinA-melittin雜合肽及其類似物都對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。

3　多肽抗生素的合成

3.1　化學(xué)合成法　

為了研究多肽抗生素的作用機(jī)制，許多天然多肽抗生素及其類似物已通過(guò)固相合成的方法得到。其中研究最多的是具有雙親螺旋結(jié)構(gòu)的帶正電荷的多肽。通過(guò)改變或增刪多肽某些位置的氨基酸，可以研究多肽抗生素一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性。在研究該類多肽抗生素與細(xì)菌細(xì)胞膜的相互作用時(shí)，利用D-型氨基酸合成了天然多肽的對(duì)映體。天然多肽形成左手螺旋，而其對(duì)映體形成右手螺旋，發(fā)現(xiàn)D-型氨基酸形成的對(duì)映體與天然多肽具有相同的生物活性，從而進(jìn)一步證明了雙親螺旋結(jié)構(gòu)在該類多肽的生物活性中具有重要作用。為了尋找具有更高抗菌活性或更廣抗菌譜的多肽抗生素，一些雜合肽相繼被合成。例如，由cecropin和melititn的前13個(gè)氨基酸組成的雜合肽CN(1～13)MN(1～13)具有很強(qiáng)的抗菌活性而無(wú)溶血活性。為了節(jié)約成本，人們也在試圖尋找更短的具有抗菌活性的小肽。化學(xué)合成法可以方便地在合成過(guò)程中改變多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)，加入特殊氨基酸，對(duì)多肽末端進(jìn)行修飾，但是昂貴的成本是限制該方法工業(yè)化應(yīng)用的最大障礙。
3.2　基因工程合成法　

利用基因工程的方法生產(chǎn)多肽抗生素是降低生產(chǎn)成本的一條有效途徑。但是多肽抗生素對(duì)原核細(xì)胞的毒性在一定程度上限制了其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。而真核表達(dá)系統(tǒng)的較低表達(dá)效率也是其工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)障礙。為了克服多肽抗生素對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的毒性，人們采用融合表達(dá)或選擇對(duì)多肽抗生素具有抗性的株系進(jìn)行原核表達(dá)。最早Jaynes于1989年在大腸桿菌中融合表達(dá)了Shiva-I基因。1993年，Piers等將defensin，HNP-1，cecropin/melittin雜合肽基因分別與4個(gè)不同的載體蛋白相融合，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量、細(xì)胞定位、蛋白降解情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。對(duì)其中的一些融合蛋白進(jìn)行化學(xué)裂解或酶解后，得到了具有抗菌活性的小肽。

1993年，Maeno 等利用鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的產(chǎn)物。1992年Reichhart等在酵母中成功表達(dá)了具有正確二硫鍵配對(duì)的綠蠅defensin A，產(chǎn)量最高可達(dá)每ml培養(yǎng)基2.5 μg。1991年，Andersons等利用多角體病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞系中表達(dá)了cecropinA的融合蛋白，C末端未見(jiàn)酰胺化，后來(lái)利用活體昆蟲(chóng)進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)量提高了60倍，并且部分產(chǎn)物被酰胺化。在國(guó)內(nèi)，謝維等在大腸桿菌中表達(dá)了家蠶多肽抗生素CMIV。1999年，沈俊卿等在酵母中表達(dá)了cecropin的類似物。

Tab 1　Therapeutic status of peptide antibiotics

4　多肽抗生素的應(yīng)用及前景

4.1　多肽抗生素在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用及前景　

目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問(wèn)題的一條有效途徑。多肽抗生素因?yàn)榭咕�活性高，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，而被認(rèn)為將會(huì)在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，已有多種多肽抗生素正在進(jìn)行臨床前的可行性研究，其中magainins已經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段。一些多肽抗生素在醫(yī)藥研究中的進(jìn)展情況見(jiàn)Table 1。

現(xiàn)在大多數(shù)臨床試驗(yàn)是用于局部治療，這種治療應(yīng)該是安全和有效的，因?yàn)橐恍┒拘愿鼜?qiáng)的多肽和脂多肽，如短桿菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮膚軟膏。這些多肽也可用于那些常規(guī)抗生素和常規(guī)療法無(wú)效的地方。利用粉劑的方法治療肺部感染是一個(gè)很有前途的發(fā)展方向。口服藥物可能會(huì)被用于治療腸道感染，nisin正在進(jìn)行抗螺旋桿菌的臨床試驗(yàn)。至少有兩個(gè)公司正在開(kāi)發(fā)非腸道給藥的治療方法。但是，多肽抗生素要真正用于臨床，必須首先要解決以下問(wèn)題：多肽抗生素的毒性、穩(wěn)定性、免疫原性、應(yīng)用方法、藥物配方。藥物配方是影響治療效果的一個(gè)主要問(wèn)題。此外，體內(nèi)蛋白酶，尤其是胰蛋白酶對(duì)多肽的降解，不同組織器官對(duì)多肽的吸收情況都有待于進(jìn)一步的研究。

4.2　多肽抗生素在其他方面的應(yīng)用及前景　

由于某些多肽抗生素對(duì)一些植物致病細(xì)菌和真菌具有很強(qiáng)的抗性，一些多肽抗生素已經(jīng)被用于植物抗病基因工程。如Jaynes等將兩個(gè)cecropin的類似物基因，Shiva-I基因和SB-37基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)Shiva-I的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病具有一定的抗性，而SB-37的轉(zhuǎn)基因煙草沒(méi)有抗性。Huang 等的研究表明將cecropin類多肽MB-39基因與大麥α淀粉酶信號(hào)肽基因融合后轉(zhuǎn)入煙草中，所得植株對(duì)野火病的抗性增強(qiáng)。在國(guó)內(nèi)，黃大年等利用cecropinB基因轉(zhuǎn)化水稻，得到了一些對(duì)水稻細(xì)條病具有不同抗性的植株。

多肽抗生素動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的研究也已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，比如可以通過(guò)基因工程的方法來(lái)阻斷一些蟲(chóng)媒疾病的傳播，Possani等［21］的研究表明，在蚊子體內(nèi)表達(dá)Shiva-3可以抑制瘧疾的傳播，但是在蚊子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面還存在著一些困難；Durasula等通過(guò)在長(zhǎng)紅獵蝽的共生菌中表達(dá)CecropinA明顯減少了其體內(nèi)錐蟲(chóng)的數(shù)量。Reed等將Shiva-Ia轉(zhuǎn)入小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)布魯氏桿菌的抵抗力顯著增強(qiáng)，這為人工培育抗病飼養(yǎng)動(dòng)物新品種提供了新思路。此外，多肽抗生素在食品防腐，鮮花保鮮和動(dòng)物飼料添加劑等方面的應(yīng)用研究也正在進(jìn)展之中。