基因芯片技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)
（作者：生物芯片上海國(guó)家工程研究中心 滕曉坤, 肖華勝）

隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟, 在功能基因組、疾病基因組、系統(tǒng)生物學(xué)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng) 用, 已經(jīng)發(fā)表了上萬(wàn)篇研究論文, 每年發(fā)表的論文呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì).

芯片制備技術(shù)極大地推進(jìn)了生物芯片的發(fā)展, 從實(shí)驗(yàn)室手工或機(jī)械點(diǎn)制芯片到工業(yè)化原位合成制備, 從幾百個(gè)點(diǎn)的芯片到幾百萬(wàn)點(diǎn)的高密度芯片, 生物芯片從一項(xiàng)科學(xué)成為一項(xiàng)技術(shù), 被越來(lái)越多的研究者廣泛運(yùn)用. 各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不斷產(chǎn)生海量的雜交數(shù)據(jù), 相同領(lǐng)域的研究者需要比較不同實(shí)驗(yàn)平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù), 作為基于分子雜交原理的高通量技術(shù), 芯片實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、可信度、重現(xiàn)性和芯片結(jié)果是否能作為定量數(shù)據(jù)等問(wèn)題成為所有的芯片使用者關(guān)心的課題. 邁阿密原則和微陣列質(zhì)量控制系列研究回答了這兩個(gè)問(wèn)題.

邁阿密原則(Minimum Information About a Micro- array Experiment, MIAME, 微陣列實(shí)驗(yàn)最小信息量)提出了生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化的概念, 該原則的制定使世界各地實(shí)驗(yàn)室的芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為所有的研究者共 享. 同時(shí), 美國(guó)國(guó)家生物信息學(xué)中心(NCBI)和位于 英國(guó)的歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)也建立了GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和ArryExpress (http:// www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)公共數(shù)據(jù)庫(kù), 接受和儲(chǔ)存全球研究者根據(jù)邁阿密原則提交的生物芯片數(shù)據(jù), 對(duì)某項(xiàng)研究感興趣的研究人員可以下載到相關(guān)課題的芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.
2006年美國(guó)FDA聯(lián)合多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了MAQC系列實(shí)驗(yàn)(micro array quality control, MAQC), 旨在研究目前所使用的芯片平臺(tái)的質(zhì)量控制. 該研究的12篇系列文章發(fā)表在2006年9月份的Nature Biotechnology上, 用嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)分析了目前主流芯片平臺(tái)數(shù)據(jù)質(zhì)量, 芯片數(shù)據(jù)和定量PCR結(jié)果之間的相關(guān)性, 芯片數(shù)據(jù)均一化方法, 不同芯片平臺(tái)之間的可重現(xiàn)性. 證明了不同芯片平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性和可重現(xiàn)性, 各種芯片平臺(tái)之間的系統(tǒng)誤差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人為操作和生物學(xué)樣品之間本身的差異, 肯定了芯片數(shù)據(jù)的可信性, 打消了以往對(duì)芯片數(shù)據(jù)的種種猜疑, 明確了基于雜交原理的芯片同樣可以作為一種定量的手段. 推動(dòng)了生物芯片技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用.

生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)是在處理基因芯片產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中必不可少的工具. 隨著芯片應(yīng)用的推進(jìn), 芯片數(shù)據(jù)分析的新理論和新算法不斷地被開(kāi)發(fā)出來(lái), 這些方法幫助生物學(xué)家從海量的數(shù)據(jù)里面快速篩選出差異表達(dá)的基因. 一次芯片實(shí)驗(yàn)獲得的是成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)信息, 任何一種單一的分析方法都很難將所有蘊(yùn)含在數(shù)據(jù)中的生物學(xué)信息全部提取出來(lái), 從近年來(lái)生物信息學(xué)研究的趨勢(shì)來(lái)看, 目前研究的重點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)向芯片數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、管理、共享和深度信息挖掘, 旨在從芯片數(shù)據(jù)中獲得更多的生物學(xué)解釋, 而不再停留在單純的差異表達(dá)基因篩選上。

目前基因芯片的制備向兩個(gè)主要方向發(fā)展. 第一, 高密度化, 具體表現(xiàn)為芯片密度的增加, 目前原位合成的芯片密度已經(jīng)達(dá)到了每平方厘米上千萬(wàn)個(gè)探針. 一張芯片上足以分析一個(gè)物種的基因組信息. 第二, 微量化, 芯片檢測(cè)樣品的微量化, 目前芯片檢測(cè)下限已經(jīng)能達(dá)到納克級(jí)總RNA水平, 這為干細(xì)胞研究中特別是IPS干細(xì)胞對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜研究提供了可能. 另一方面, 微量化也體現(xiàn)芯片矩陣面積的微量化, 即在同一個(gè)芯片載體上平行的進(jìn)行多個(gè)矩陣的雜交, 大大減少系統(tǒng)和批次可能帶來(lái)的差異, 同時(shí)削減實(shí)驗(yàn)費(fèi)用.

微陣列技術(shù)改變了生物學(xué)研究的方法, 使得微量樣品快速高通量的分析成為可能, 從單個(gè)基因的研究迅速擴(kuò)展到全基因組的系統(tǒng)生物學(xué)研究. 微陣列技術(shù)幫助生物學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代, 研究成果層出不窮。

2001年國(guó)家人類基因組南方研究中心韓澤廣博士研究小組利用cDNA芯片對(duì)肝癌和正常組織中的12393個(gè)基因和EST序列進(jìn)行了表達(dá)譜篩查, 其中發(fā)現(xiàn)了2253個(gè)基因和EST在肝癌中發(fā)生了差異表達(dá), 并對(duì)這些差異基因的信號(hào)通路進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)WNT信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生中出現(xiàn)了表達(dá)異常. 2002年中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張旭博士研究組利用表達(dá)譜芯片對(duì)大鼠外周神經(jīng)損傷模型背根神經(jīng)節(jié)的基因表達(dá)進(jìn)行了研究, 通過(guò)對(duì)7523個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)譜篩查, 發(fā)現(xiàn)一批與神經(jīng)損傷和疼痛相關(guān)的基因和潛在的藥物靶點(diǎn), 并解釋了臨床上使用的Gabapentin治療疼痛的分子機(jī)制. 同年Nature發(fā)表的荷蘭癌癥研究所的研究小組利用表達(dá)譜芯片對(duì)乳腺癌患者5年內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分子水平的分型工作, 研究結(jié)果顯示可以利用基因表達(dá)譜的差異來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后情況. 這項(xiàng)工作成為用表達(dá)譜對(duì)疾病進(jìn)行分子分型和預(yù)后研究的經(jīng)典案例. 2006年根據(jù)這項(xiàng)研究成果生產(chǎn)的表達(dá)譜芯片成為第一張通過(guò)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用的表達(dá)譜芯片, 邁出了芯片從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的第一步.

2003年啟動(dòng)的人類基因組單體型計(jì)劃(Interna- tional Hapmap Project)采用了5個(gè)不同的高通量平臺(tái)進(jìn)行基因分型工作, 其中芯片完成了超過(guò)50%的工作量. 2005年Gunderson等人用DNA芯片檢測(cè)人類基因組中的SNP位點(diǎn)， 芯片的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的基于PCR技術(shù)的基因分型具有非常好的相關(guān)性. Roch 的Amplichip CYP450檢測(cè)芯片在2005年通過(guò)了FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用, 用以檢測(cè)患者體內(nèi)決定細(xì)胞色素氧化酶活性的多態(tài)性位點(diǎn), 預(yù)測(cè)患者藥物代謝水平的高低, 這也是第一張進(jìn)入臨床檢查的SNP芯片. 2007年Burton 等人利用微陣列檢測(cè)了1000例四種疾病患者和對(duì)照組的1500例健康人的14000多個(gè)SNP位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)了患者與健康人自身免疫方面存在的基因組SNP位點(diǎn)差異性.

2006年國(guó)家人類基因組南方研究中心和生物芯片上海國(guó)家工程研究中心合作, 利用比較基因組雜交(aCGH)和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析了肝癌樣品中基因組拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)量變化的相關(guān)性, 為從基因組結(jié)構(gòu)變異角度研究肝癌的發(fā)生機(jī)制提供了研究基礎(chǔ). 2007年Carter等人報(bào)道利用SNP芯片檢測(cè)基因組拷貝數(shù)變化(copy number variation), 發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在約12%的拷貝數(shù)變異, 這一發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)出乎以前人們對(duì)人類基因組多樣性的預(yù)測(cè). 2008年Lee等人報(bào)道了用比較基因組雜交(aCGH)對(duì)遺傳疾病進(jìn)行分型, 發(fā)現(xiàn)了存在于精神發(fā)育遲緩病人染色體15q13.3區(qū)域的一個(gè)缺失, Nature Genetics刊登了這一結(jié)果.

小RNA或非編碼RNA(ncRNA)是新興的一個(gè)研究領(lǐng)域. 這類小分子RNA在生理過(guò)程中扮演著調(diào)控分子的角色, 在發(fā)育過(guò)程和人類疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用. 這些小分子核酸高度同源, 序列差異往往就是一個(gè)堿基, 且長(zhǎng)度在21~35堿基之間, 這對(duì)芯片檢測(cè)是一個(gè)很大的挑戰(zhàn), 要求既能檢測(cè)到低分子量的目的片段, 又能區(qū)分一個(gè)堿基的差異, 芯片技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)部分解決這些問(wèn)題, 利用芯片檢測(cè)小分子RNA的表達(dá)譜成為腫瘤分型的另一種途徑, 在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等疾病的分子分型和分子標(biāo)志物尋找中取得非常好的結(jié)果.

DNA修飾以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控方式. 2007年Meier等人采用ChIP-chip實(shí)驗(yàn)方法, 檢測(cè)到了發(fā)生DNA損傷時(shí), 相應(yīng)的修復(fù)因子在DNA上的分布. 同年, Guenther等 人用ChIP-chip實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄起始可能不是特異的, 大多數(shù)的人類基因包括原來(lái)被證明轉(zhuǎn)錄失活的編碼基因都能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄, 細(xì)胞通過(guò)對(duì)基因組的修飾來(lái)控制轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程, 從而達(dá)到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的目的. 2008年Lupien等人用ChIP-chip和一系列的實(shí)驗(yàn), 證實(shí)了基因組表觀遺傳學(xué)修飾能調(diào)控FoxA1, 通過(guò)FoxA1改變?nèi)旧�質(zhì)的結(jié)構(gòu), 從而控制基因的組織特異性表達(dá).

基因芯片的應(yīng)用加速了生命科學(xué)研究的進(jìn)程, 微量化并行化的分析幫助科學(xué)家從海量數(shù)據(jù)中發(fā)掘有用的信息.