A 原代細(xì)胞分離技術(shù)

取人或動物體內(nèi)（或胚胎）的組織，將其剪碎至1mm3的組織塊，再采用的如下方法進(jìn)行分離培養(yǎng)：

一、懸浮細(xì)胞的分離方法
1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。
2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。
3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。
4、如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。

二、實體組織材料的分離方法 
（一）機械分散法
1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。
2、用PBS清洗兩次后
①用吸管吹打，分散組織細(xì)胞。
②或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出。
③或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
3、收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。
4、去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

（二）消化分離法
1、酶消化分離法（過夜冷消化法）
①細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。
③加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜。
④次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散，細(xì)胞計數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
①把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。
②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。
④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。
⑤用吸管吹打，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。

B 原代細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)

1、棄去培養(yǎng)基廢液。
2、消化：加入1ml 0.125％胰酶溶液，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使酶液浸沒瓶底，溫浴消化2-3分鐘。 
3、終止：用無血清培養(yǎng)基終止酶反應(yīng)。
4、離心：收集中和了的培養(yǎng)液，于15ml 的離心管中 1000rmp 離心10分鐘。
5、細(xì)胞重懸：棄去上清，加入1ml 無血清培養(yǎng)基用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液。
6、細(xì)胞計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，并換算出細(xì)胞數(shù)量。
7、接種分瓶： 將細(xì)胞接種到含4ml無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 
8、鏡檢觀察：次日觀察貼壁率，細(xì)胞形態(tài)等。


C 原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

一、組織塊直接培養(yǎng)法
1、取材，用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3左右的小塊，再用Hank’s液洗三次。
3、將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面。
4、輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，向瓶內(nèi)注入適量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放置在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
5、放置待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

二、消化培養(yǎng)法
1、取材，用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3左右的小塊，再用Hank’s液洗三次。
3、視組織塊量加入酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
4、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關(guān)酶抑制劑）。
5、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
6、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。
7、加入Hank’s液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
8、加入培養(yǎng)液1—2ml（視細(xì)胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
9、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

三、 器官培養(yǎng)
1、將不銹網(wǎng)做成支架形狀，調(diào)整其高度至培養(yǎng)皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。
2、將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。
3、將要培養(yǎng)器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2。
4、將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO2培養(yǎng)箱，并加注氧氣調(diào)整氧分壓，最好到90%。
5、培養(yǎng)過程中要注意觀察培養(yǎng)液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
6、上述可進(jìn)行器官培養(yǎng)1-3周，每2-3天換液一次，并根據(jù)情況做進(jìn)一步實驗和檢測。

D 原代細(xì)胞傳代技術(shù)


一、貼壁細(xì)胞的消化法傳代
1、吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。
3、消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時，棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。
4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細(xì)胞的傳代
1、直接傳代
① 讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3。
② 用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、離心法傳代
① 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心800-1000rpm，5分鐘。
② 去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細(xì)胞懸液。
③ 將細(xì)胞懸液分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

E 原代細(xì)胞染色技術(shù)

一．臺盼藍(lán)染色
（1）制備單個細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋（106細(xì)胞/ml)。
（2）染色：取9滴細(xì)胞懸液移入小試管中，加一滴0.4%臺盼藍(lán)溶液，混勻。
（3）計數(shù)：在3分鐘內(nèi)，用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。
（4）鏡下觀察，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。
（5）根據(jù)下式求細(xì)胞活力: 
 
二．伊紅Y染色
（1）制備1×106-5×106細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液。
（2）取0.1ml細(xì)胞懸液加0.1ml伊紅Y染液混合。
（3）用計數(shù)板鏡下計數(shù)活、死細(xì)胞數(shù)。
（4）鏡下觀察，著紅色的為死細(xì)胞。按公式計算細(xì)胞活力。

三．苯胺黑染色實驗
（1）制備1×106-5×106細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液。
（2）將1份1%苯胺黑溶液與含血清生理鹽水作1：9混合稀釋，使其成0.1%苯胺黑染液。
（3）取0.1ml細(xì)胞懸液加0.1ml苯胺黑染液混合。室溫放置10分鐘。
（4）用計數(shù)板鏡下計數(shù) ，黑色細(xì)胞為死細(xì)胞，按公式計算活細(xì)胞率。      

F 原代細(xì)胞計數(shù)技術(shù)


1、準(zhǔn)備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后輕輕拭干。
2、制備細(xì)胞懸液：用消化液分散單層培養(yǎng)細(xì)胞或直接收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液。要求細(xì)胞密度不低于104/ml，若細(xì)胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液離心（1000rpm，2分鐘），重懸浮于少量培養(yǎng)液中。
3、加樣：用習(xí)慣輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液。
4、計數(shù)：計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：
     細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000。

G 原代細(xì)胞鑒定技術(shù)

一、形態(tài)學(xué)鑒定
1. 在倒置顯微鏡中直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
2. 細(xì)胞染色檢查 ：
a) 將無菌玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加細(xì)胞懸液后培養(yǎng)；
b) 待細(xì)胞長滿玻片后取出，用PBS清洗，之后放于載玻片上，待其自然干燥；
c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分鐘；
d) 棄固定液，加合適的染色液染色；
e) 染色完畢后用清水洗凈，置于空氣中干燥，
f) 干燥后，用二甲苯透明，光學(xué)樹脂封片后觀察。

二、免疫組織細(xì)胞化學(xué)鑒定
1. 將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片；
2. PBS清洗標(biāo)本3次，各1 分鐘；
3. 4%多聚甲醛固定15分鐘；
4. 置于空氣中干燥；
5. PBS清洗標(biāo)本3次，各2 分鐘；
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分鐘；
7. PBS清洗標(biāo)本 3次 各2分鐘；
8. 3%H2O2孵育 15分鐘；
9. DPBS清洗標(biāo)本 3次 各2 分鐘；
10. 封閉血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分鐘）
11. 一抗孵育，4℃ 過夜或37℃ 60 分鐘；
12. PBS清洗標(biāo)本3次 各5 分鐘；
13. 二抗工作液孵育（濕盒）37℃ 30 分鐘；
14. PBS清洗標(biāo)本3次 各5 分鐘；
15. C液（濕盒） 37℃ 30 分鐘；
16. PBS清洗標(biāo)本3次，各5 分鐘；
17. 用顯色液進(jìn)行顯色；
18. 蒸餾水洗滌2次1 分鐘；
19. 蘇木素復(fù)染1分鐘；
20. 清水洗滌30分鐘；
21. 光學(xué)樹脂封片后觀察。

H 原代細(xì)胞凍存技術(shù)

1、選用生長情況好，數(shù)量較多的原代細(xì)胞，凍存前一天換液一次。
2、貼壁細(xì)胞需用0.25％胰酶常規(guī)消化將細(xì)胞消化下來，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
3、1000rpm離心5分鐘，棄上清液。
4、沉淀加含DMSO的培養(yǎng)液，計數(shù)，調(diào)整至（1-10）×106/ml。
5、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
6、密封凍存管，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。
7、用記號筆標(biāo)明細(xì)胞種類，凍存日期。
8、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（－80℃過夜）→液氮。

I 原代細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)

1、取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。
2、吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。
3、1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清。
4、用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
     鏡檢細(xì)胞貼壁能力。次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。