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實驗技術:細胞培養(yǎng)基本技術

瀏覽次數:3223 發(fā)布日期:2009-11-9  來源:長沙贏潤

  細胞培養(yǎng)

一、操作規(guī)程:

1.實驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60分鐘滅菌,70%酒精擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風機運轉10分鐘后,才可開始實驗操作.每次操作只處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染.實驗結束后,將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續(xù)進行下一個實驗,則用70%酒精擦拭無菌操作臺面,再讓無菌操作臺風機運轉10分鐘后,才可進行下一個實驗操作。

2.無菌操作工作區(qū)域應保持清潔與寬敞,必要物品,如試管架,移液器或吸管頭等可以暫時放置,其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通.實驗用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

3.小心取出無菌實驗用品,避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口,不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,用手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

4.工作人員應注意自身的安全,必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心,并選擇適當等級的無菌操作臺(至少兩級)。操作過程中,應避免引起氣溶膠的產生,小心有毒性試劑,例如DMSOTPA,并避免尖銳物品傷人等。

5.定期檢查下列項目:CO2鋼瓶內的CO2壓力;CO2培養(yǎng)箱內的CO2濃度,溫度,及水盤是否有污染;無菌操作臺內氣流壓力是否正常,定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000/HEPA)。

二、粉末細胞培養(yǎng)基的配制(1 升為例)

    細胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清,因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml,pH 7.2 - 7.4NaHCO3另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成 pH 之誤差,或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調整pH,而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),因為氯離子對細胞生長可能有影響,且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。

【試劑與設備】

1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水,水品質非常重要)

2. 粉末培養(yǎng)基 (1640、DMEM等)
3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
4.
電磁攪拌器
5.
無菌血清瓶
6. 0.22
微米無菌過濾膜
7. pH meter
8.
真空瓣
9. CO2
氣體
配制步驟】
1.
取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
2.
稱取適量之NaHCO3粉末(數量依培養(yǎng)基種類而異)溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2氣體至飽和,約3-5 分鐘。
3.
將溶解且含飽和CO2 NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合;旌笕芤褐pH 應為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調整之。若為太堿,可再通入CO2 氣體調整pH。培養(yǎng)基以真空幫助通過過濾膜時,pH 會升高0.1-0.2。
4.
0.1 0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時分裝至無菌容器中,標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等,貯存于4℃ (血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)。
5.
配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
【注意事項】

1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 ℃冰箱,避免光照,實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。

2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月,期間glutamine 可能會分解,若細胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
來源:長沙贏潤生物技術有限公司
聯系電話:0731-84317068
E-mail:1670829912@qq.com

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