免疫組織化學(xué)染色方法(S-P法)
免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)是根據(jù)免疫學(xué)原理,利用抗體同特定抗原專(zhuān)一結(jié)合,對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)?乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子;抗體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物,再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng),即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。
常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。熒光素標(biāo)記的稱(chēng)為免疫熒光法(immunofluorescent technique),常用的螢光素有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate)、羅丹明(rhodamine)等。酶標(biāo)記的稱(chēng)為酶標(biāo)免疫法(enzyme-labeled antibody method),常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase),酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物,從而顯示出抗原存在的部位。
抗體與抗原的結(jié)合方法可分為直接法和間接法兩種,直接法是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng),顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級(jí)反應(yīng)的基礎(chǔ)上,再用帶標(biāo)記的次級(jí)抗體同初級(jí)抗體反應(yīng),從而使初級(jí)反應(yīng)得到放大,顯示增強(qiáng)。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1、石蠟切片4-5μm;
2、切片脫蠟至水;
3、3%甲醇雙氧水阻斷室溫10分鐘;
4、 0.01M(PH 7.2)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5分鐘´3次;抗原修復(fù),加入0.01M(PH 6.0)檸檬酸緩沖液置微波爐中10檔3分30秒,之后可進(jìn)行2檔1分至1分30秒微波維持。
5、自然冷卻后PBS洗,加二抗同種動(dòng)物非免疫血清封閉,室溫10分鐘;
6、免洗,傾出血清,分別滴加配制好的一抗4℃過(guò)夜;
7、PBS洗5分鐘 ´ 3次;
8、滴加生物素標(biāo)記的第二抗體,室溫孵育10分鐘;
9、PBS洗5分鐘 ´ 3次;
10、滴加鏈親和素-過(guò)氧化物酶,室溫10分鐘;
11、PBS洗5分鐘 ´ 3次;
12、新鮮配制的DAB溶液顯色3-10分鐘;
13、自來(lái)水洗,蘇木素淺染細(xì)胞核,分化。自來(lái)水沖洗返蘭,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固。