轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展及其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的應(yīng)用
轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展
自從人類學(xué)會(huì)蓄養(yǎng)動(dòng)物、耕作植物以來，我們的祖先就從未停止過對(duì)物種的遺傳改良。過去的幾千年里改良物種的主要方式：針對(duì)自然環(huán)境造成的突變或無意的人為因素所產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組個(gè)體進(jìn)行選育和利用，從而通過隨機(jī)和自然的積累優(yōu)化基因。然而這種極低幾率且無人類控制性的被動(dòng)模式大大阻礙了農(nóng)業(yè)的發(fā)展，迫切地需要一門新興科學(xué)。自遺傳學(xué)創(chuàng)立后改觀了這一境遇，動(dòng)植物育種采用人工雜交的方法進(jìn)行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導(dǎo)入，從而實(shí)現(xiàn)遺傳改良。
因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)在本質(zhì)上都是通過獲得優(yōu)良基因進(jìn)行遺傳改良。但在基因轉(zhuǎn)移的范圍和效率上，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)區(qū)別于兩點(diǎn)：首先，傳統(tǒng)技術(shù)一般只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關(guān)系的限制；第二，傳統(tǒng)的雜交和選擇技術(shù)一般是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準(zhǔn)確地定位于某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表型預(yù)見性較差。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所操作和轉(zhuǎn)移的是經(jīng)過明確定義的基因，功能清楚，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)后代。故轉(zhuǎn)基因技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展和補(bǔ)充，兩者的結(jié)合可以極大地提高動(dòng)植物品種改良的效率。
在轉(zhuǎn)基因發(fā)展的過程中，從早期單純進(jìn)行科研研究拓展到目前研究和應(yīng)用齊頭并進(jìn)，生物學(xué)科與其他領(lǐng)域的交叉有著不可忽略的重要作用，如生物物理產(chǎn)生的顯微鏡技術(shù)，以及日益發(fā)展的電穿孔技術(shù)，極大地促進(jìn)了科研走向應(yīng)用。
在當(dāng)今轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中電穿孔技術(shù)的應(yīng)用范圍最廣，早在1982年Neumann.E將外源DNA在電場(chǎng)條件下導(dǎo)入小鼠真核細(xì)胞[1]，從而實(shí)現(xiàn)了基因重組和外源基因的功能研究。隨之這一技術(shù)得到了廣泛的運(yùn)用，如細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞的體外應(yīng)用如Simon, J. R[2]；以及器官植入、皮膚損傷修復(fù)的電化學(xué)療法、疫苗的注射等體內(nèi)體外臨床應(yīng)用，如S.Tollefsen, et al[3]；小分子或大分子物質(zhì)功能性研究；研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物新品種等，本文下文就將特別介紹轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的應(yīng)用。
電穿孔技術(shù)主要包括電轉(zhuǎn)染和電融合：電轉(zhuǎn)染是利用脈沖電場(chǎng)將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞處于高壓電場(chǎng)時(shí)，瞬時(shí)電脈沖可將細(xì)胞膜穿孔產(chǎn)生可逆性孔徑，從而DNA進(jìn)入細(xì)胞與染色體整合；電融合是利用高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖，引起相鄰的細(xì)胞融合。
電穿孔技術(shù)的簡(jiǎn)單原理與應(yīng)用如下圖：
圖1：電穿孔前后細(xì)胞質(zhì)膜的變化示意圖
圖2：電穿孔原理和應(yīng)用示意圖
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
1981年，第一次成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)入大鼠的生長(zhǎng)激素基因，使小鼠體重為正常個(gè)體的二倍，因而被稱為“超級(jí)小鼠”，這些開拓了轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物–無性生殖技術(shù)。1997年英國(guó)I. Wilmut等，用綿羊乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，成功得到了克隆羊“多莉”，證實(shí)了高等哺乳動(dòng)物也可以突破有性生殖繁殖后代。
核顯微注射法則是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中早期最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因注射到受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，注射的外源基因與胚胎基因組融合，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，最后移植到受體母畜子宮內(nèi)發(fā)育，這樣分娩的動(dòng)物體內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞都含有新的DNA片段。然而這種方法的缺點(diǎn)是效率較低、位置效應(yīng)(外源基因插入位點(diǎn)隨機(jī)性)造成的表達(dá)結(jié)果的不確定性、動(dòng)物利用率低等，在反芻動(dòng)物還存在著繁殖周期長(zhǎng)，有較強(qiáng)的時(shí)間限制、需要大量的供體和受體動(dòng)物等特點(diǎn)。
體細(xì)胞核移植是近些年來新出現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該方法是先把外源基因與供體細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細(xì)胞上，然后將供體細(xì)胞細(xì)胞核移植到受體細(xì)胞——去核卵母細(xì)胞，構(gòu)成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動(dòng)物。在這一技術(shù)中，外源基因的穩(wěn)定表達(dá)和重建胚的良好發(fā)育是關(guān)鍵因素，則選擇合適的基因轉(zhuǎn)染方式和細(xì)胞融合方式就顯得尤為重要。
與傳統(tǒng)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必像顯微注射那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對(duì)成百萬的細(xì)胞進(jìn)行注射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。第三，因?yàn)殡姶┛资且环N物理方法，較少依賴細(xì)胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。已有多篇科研文獻(xiàn)證實(shí)了電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因研究和臨床研究上的作用，如Diego Laderach, et al[4]使用BTX ECM830以方波波形電擊DC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染siRNA研究體內(nèi)定位基因的功能，類似這種用以研究某基因的方法已相當(dāng)成熟；以及Annelies E.P, et al[5]運(yùn)用BTX ECM2001交流電排列細(xì)胞和直流電進(jìn)行電擊達(dá)到了目的基因的穩(wěn)定表達(dá)和胚胎細(xì)胞的良好融合，最終得到轉(zhuǎn)基因牛，等等。而BTX ECM2001細(xì)胞電融合&電穿孔儀已被美國(guó)權(quán)威實(shí)驗(yàn)室冷泉港列入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作程序。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以建立多種疾病的動(dòng)物模型，進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法，而電穿孔技術(shù)的應(yīng)用可以針對(duì)性地制備抗性藥物；以及通過與化學(xué)學(xué)科的交叉，利用電化學(xué)療法注射抗癌藥以治療皮膚型腫瘤疾病。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)配合電穿孔技術(shù)還可以改造動(dòng)物的基因組，使家畜、家禽的經(jīng)濟(jì)性狀改良更加有效，如使生長(zhǎng)速度加快、瘦肉率提高，肉質(zhì)改善，飼料利用率提高，抗病力增強(qiáng)等。對(duì)于動(dòng)物遺傳資源保護(hù)的意義更加深遠(yuǎn)，對(duì)挽救瀕危物種是必不可少的。
轉(zhuǎn)基因植物
近些年來，面對(duì)全球環(huán)境劇變所引發(fā)的諸多農(nóng)業(yè)問題，如耕地面積減少、空氣質(zhì)量下降等造成早期改良品種的方法已不合時(shí)宜，迫使轉(zhuǎn)基因技術(shù)充分考慮各種因素，以達(dá)到人口不斷增加對(duì)植物包括糧食及其他食品的需求�；蚬こ虘�(yīng)用技術(shù)之一的基因重組，可用于不同生物遺傳物質(zhì)進(jìn)行體外人工剪切、組合、拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后，通過載體，如微生物、病毒等轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行"無性繁殖"，并使所需基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出來，產(chǎn)生人類所需的物質(zhì)或創(chuàng)造新的物種。
近年來，國(guó)外已出現(xiàn)了一些"轉(zhuǎn)基因作物"，如抗腐爛西紅柿、抗除草劑棉花、抗病毒黃瓜和馬鈴薯，以及抗蟲玉米等。這些都是運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入受體植物體內(nèi)，可用電轉(zhuǎn)染方法、基因槍或者是傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染等�；驑尫椒ǖ男瘦^高但是價(jià)格昂貴；傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染易污染且效率低，外界不確定因素較多；相比較，大多數(shù)研究使用電轉(zhuǎn)染方法獲得轉(zhuǎn)基因植物，如在James Saunders等利用BTX630電轉(zhuǎn)儀得到轉(zhuǎn)基因大豆[6]。
轉(zhuǎn)基因植物可通過原生質(zhì)體融合獲得，有可能改變植物的某些遺傳特性，不僅可以改良作物特性，還可培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病毒、抗蟲、抗寒、抗旱、抗?jié)�、抗鹽堿、抗除草劑等的作物新品種。而且可用轉(zhuǎn)基因植物或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，來生產(chǎn)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，如人的生長(zhǎng)素、胰島素、干擾素、白介素2、表皮生長(zhǎng)因子、乙型肝炎疫苗等已在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)。
結(jié)束語：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的理論研究和實(shí)際應(yīng)用，特別是極大推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物新品種的培育。而我國(guó)已啟動(dòng)了“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育”科技重大專項(xiàng)，隨著這些科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，必將大大促進(jìn)中國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。
參考文獻(xiàn)：
【1】Neumann, E., Schaefer-Ridder, et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J,1982;1:841–845.
【2】Simon, J. R. Transformation of intact yeast cells by electroporation. Methods Enzymol,1993;217: 478–483.
【3】S.Tollefsen, et al.DNA injection in combination with electroporation: a novel method for vaccination of farmed ruminants. Scandinavian journal of immunology,2002;57：229-238.
【4】Diego Laderach, et al.RNA Interference Shows Critical Requirement for NF-kβ p50 in the production of IL-12 by Human Dendritic cells.The Journal of Immunolgy,2003;1750-1757.
【5】Annelies E.P,et al.Nuclear Transfer and Electrofusion in Bovine In Vitro-Matured/In Vitro-Fertilized Embryos: Effect of Media and Electrical Fusion Parameters.Molecular Reproduction,1993;36:307-312.
【6】James Saunders,et al.Rapid optimization of Electroporation Conditions for Plant Cells,Protoplasts and Pollen.Molecular Biotechnology,1995;3:181-190.
參考網(wǎng)站：
http://www.btxonline.com
有大量轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實(shí)驗(yàn)程序和文獻(xiàn)可下載
