雙向電泳篇
1. 重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？
一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。

2. 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？
這是因為 BioRad 的電泳槽有個蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個蓋子上設計了對應的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個突起會導引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個現象的發(fā)生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。

3. 跑第一向時，為什么要設定一個電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)？
電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，從而對等電聚焦產生影響。

4. 跑第一向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？
剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由于這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區(qū)域移動。

5. 跑第一向時，為什么會產生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？
藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區(qū)時（ pH4 ），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發(fā)生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質大分子聚焦之前。

6. 跑第一向時，為什么電壓總達不到預定值？
當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。

7. 跑第一向時，在電壓達到預定值后，電流為什么會降低？
當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區(qū)域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。

8. 跑第一向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產生？
等電聚焦完成后，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區(qū)域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。

9. 重泡脹緩沖液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？
硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。

10. 怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？
可以用 BioRad 生產的 2D 膠標準蛋白來校準。也可以用體系內已知蛋白來做比對。

11. 為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？
橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不完全； 2 ）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因為跑二向時，蛋白的溶解度不好。

12. 什么成分會影響 2D 膠的效果？
核酸，鹽，去垢劑等等。

13. 2D 膠的上樣量應該在什么范圍？
上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。

14. 我的蛋白質濃度很低，應該用什么方法來濃縮？
蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。 透析法可以和超濾法聯(lián)用。先把樣品透析到一個比較干凈的環(huán)境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。

酶解篇
1. 用 Trypsin 酶解蛋白質時，碳酸氫氨的濃度應該是多少？
酶解時碳酸氫氨的濃度一般在 10 ～ 50 mM 之間。碳酸氫氨的作用主要是提供一個堿性的水解環(huán)境，因為 Typsin 的活力在 pH8 ～ 9 之間最高。最常用的碳酸氫氨濃度有 20 mM ， 40 mM 。鹽濃度過大時，后續(xù)的凍干過程中會有較多的鹽析出；鹽濃度過小時，則不能有效的提供堿性 pH 的水解環(huán)境（尤其是在樣品的 pH 值低，而且體積大時）。為了確定酶解體系的 pH 值，可以用

2. Trypsin 儲存液的作用是什么？
Trypsin 在 pH8 ～ 9 活力最高，所以為了防止酶的自水解， Trypsin 母液要處于一個酸性的環(huán)境里以便長期保存。 Trypsin 儲存液的 pH 大約是 5.3 ，是用來稀釋母液用的。如果所需的酶量較大，可以直接用碳酸氫氨溶液來稀釋母液。如果酶解的樣品少，可以用儲存液來稀釋，這樣剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。

3. Roche 的酶和 Promega 的酶，那個更好？
Roche 的酶有自降解，而 Promega 的酶基本上沒有自降解。由于酶的自降解峰可以用來做很好的內標，所以一定限度的酶自降解對 MALDI 數據的校準很有幫助。

4. 什么情況下需要用 Ziptip 來處理樣品？
當樣品含有大量的鹽時，需要用 Ziptip 來除鹽；當樣品量很少，但體積比較大時（ 20 微升以上）時，需要用 Ziptip 來濃縮。如果樣品中有甘油， SDS ，或其他雜質時， Ziptip 的使用要格外當心，在這種情況下， Ziptip 的填料容易被雜質堵塞；另外 Ziptip 使用不當時，樣品會有損失。所以當樣品比較珍貴（的來不易）時，最好先用其他樣品做預實驗，摸順條件后，再作真正的樣品。

MALDI 篇
1. 怎樣郵寄我的樣品？
凍干的膠或干粉可以直接郵寄。切膠后的濕膠（不用做任何處理），放在 EP 管中 ( 不加任何緩沖液 ) ；用干冰速凍；郵寄時，置樣品于足夠的干冰中。液體樣品的郵寄方式同濕膠一樣。

2. 為什么要使用內標？
用內標做校準可以大大減少 MALDI-MS 的誤差（ <70ppm ），從而提高查庫結果和可靠性。好的內標肽段需要有以下的要求：最好有兩個肽（兩點一線）；質量不要在大多數的肽段范圍內（ 1200 ～ 2500 Da ）；內標的量要與樣品的量成比例；內標對其他肽段離子化的抑止要小。我們實驗室使用的內標是 25fmol 的――和――。不過，一般情況下，使用外標做校準也可以達到比較滿意的數據（ <150ppm ）。所以，顧客可以根據自己的需要來選擇是否使用內標。

3. 我為什么還要提供正負空白膠正對照提供 (exact) 對照兩塊膠？
正負對照的兩塊膠是用來對整個鑒定過程做質量控制的。負對照（空白膠）主要是看樣品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正對照（已知膠，比如同一塊膠上的標準蛋白）主要是檢測酶解和質譜的效果是否正常。如果客戶不能提供正負對照，我們可以使用自己預先準備的膠條。如果顧客的樣品量大（ >10 個 2D 膠上的點），則顧客必須提供正負對照。

4. 對于膠上蛋白質的鑒定，我應該提供多少蛋白質？
一般情況下，考染能看得見的點都有機會鑒定出來。分子量在 2 － 5 萬之間的蛋白質，鑒定成功率一般比較大。分子量小的蛋白酶切位點少，合適的肽段（ 1000 ～ 3000 Da ）就少，所以鑒定的成功率相對較低。而分子量太大的蛋白質，在同等質量的情況下，蛋白的摩爾數 (pmol) 較少；而且查庫時匹配肽段的覆蓋率會比較低（因為整個蛋白質較大），從而影響鑒定的成功率。

5. 為什么我的 MALDI 圖譜中都是相差 44Da 的峰，肽段的峰則全被抑制了？
相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰 ，也可能是 polymer （ -CH2CHOH- ）峰。這些 polymer 是從 EP 管的內壁瀝濾（ leaching ）出來的。所以 樣品中不能含有 Triton X 。 另外實驗中不能使用加有可塑劑（ plasticizer ）或塑料軟化劑的離心管（比如 PCR 管）來裝取樣品。最好是使用進口 EP 管。另外，可以用 60 ％的乙腈 /0.1%TFA 去清洗 EP 管的內壁以防瀝濾。清洗后，要等到殘留液都揮發(fā)（ air dry or speed vac ）后再裝樣品。 此過程中要注意不讓雜質灰塵落入管內。 另外，試驗操作過程中所佩戴的塑膠手套也可能有可塑劑。所以一定要佩戴無塵的手套。每次用手打開或觸摸盛有樣品的 EP 管時，一定注意不要碰到 EP 管蓋的內壁。開蓋時，可以使用 Eppendorf 槍上的金屬拉桿（動作如開啤酒瓶蓋兒）。從凍干機中取出 EP 管時，最好拿在蓋子和管子的連接部分或蓋子的突出部分。膠的染色和脫色中，盡量不要觸摸膠（即便是帶了手套）。可以用廚房用的鏟子（帶鏤空的那種，超市里有賣）來操作。

6 ．各種去垢劑對 MALDI 有何影響？
離子型去垢劑對 MALDI 的影響要比非離子型去垢劑大。去垢劑濃度越高，影響越大。
在濃度為 1.0% (w/v) 時 : 除了一些糖類的非離子型去垢劑，大部分去垢劑會把蛋白質的信號減低 10 倍。
At 0.01% detergent concentration (w/v): 只有 SDS 和牛磺膽酸影響信號。但它們會使信號減低超過 20 倍。
在濃度為 0.1% (w/v) 時 : 不同的去垢劑對信號的影響差別比較大。具體效果見下 表。信號指有去垢劑時的信號和無去垢劑時的信號之比。

參考文獻： Vorm, Ole, Brian T. Chait and Peter Roepstorff, Mass Spectrometry of Protein Samples Containing Detergents , 41th ASMS Conference Proceedings, (1994) 621a-621b.

7 ． 為什么我的 MALDI 圖譜中都是相差 111Da 的峰？
有可能樣品在超慮時接觸了聚砜樹脂（ polysulfone ）的膜。 Polysulfone 有四個峰。各個系列的峰之間相差 111Da 。

8. 怎樣避免角蛋白的污染？
常見的角蛋白有四種，主要是從皮膚屑（直接接觸）和頭皮屑（空氣傳播）中來的。質譜中 檢測到的角蛋白峰應該是在酶解前就進入樣品中來的（主要是在染膠，脫色，切膠和加酶這四步）。試驗中一定要佩戴手套；一定要仔細清洗染膠的容器（先用 70 ％酒精洗，再用去離子水洗）；切膠要帶口罩，并在通風櫥中進行。另外，從來源于實驗操作人員穿著的毛衣中的羊的角蛋白也被檢測到過，所以試驗中要穿試驗服。

9 ． MALDI 檢測時，有那些常見的角蛋白峰？
質譜中常見的角蛋白峰有：
1319.575, 1349.679, 1474.741, 1474.777, 1656.785, 1706.742, 1715.843, 1739.697, 1790.719, 1838.984, 1889.849, 1992.969, 2090.874, 2285.116, 2382.943, 2399.203, 2500.059, 2509.123, 2650.381, 2704.152, 2830.185, 3222.272, 3223.368, 3311.299

其中最常見，強度又高的有 ( 按強度排列 ) ：
1. 2382.9
2. 1706.7
3. 2704.1
4. 3311.3

這些數據是從多次實驗中總結得來的，實驗條件不同，可能會得到不同的結果。

10. 單一同位素肽段質量（monoisotopic peptide mass）和平均同位素肽段質量（average peptide mass）有什么不同？
組成蛋白質的原子在自然界中存在著不同比例的同位素（見下表）。所以含有這些同位素原子的肽段的質量比不含任何同位素的肽段的質量要大。不含任何同位素的肽段的質量叫單一同位素肽段質量；同一種肽段所有的同位素形式（包括含同位素的，也包括不含同位素的）的質量的平均數叫平均同位素肽段質量。

11. 怎樣在質譜的圖譜上確定單一同位素峰和平均同位素峰?
在分辨率低的質譜圖譜上，所顯示的峰一般是平均同位素峰。但目前常用的質譜方法（比如 MALDI-TOF ）分辨率一般都很高，一般的小分子（比如肽段）常含有 4 到 5 個同位素峰，其中分子量最小的那個就是單一同位素峰。但是，當用質譜檢測大分子（比如完整蛋白質）時，同位素峰的數目很多，難以在圖譜上區(qū)分。在這種情況下，使用平均同位素質量會比較更有意義。

12. 同位素峰之間一定是相差 1 Da 嗎？
同位素肽段的質量（ m ）一般是相差 1 Da ，但因為質譜檢測到的峰是肽段的質荷比（ m/z ），而不是質量本身，所以在肽段帶有多個電荷的情況下，其質荷比相差要小于 1 。如果檢測到的肽段帶一個電荷，那同位素峰之間是相差 1 ；如果檢測到的肽段帶兩個電荷，那同位素峰之間便相差 0.5 ；如果檢測到的肽段帶三個電荷，那同位素峰之間便差 0.33 ；以此類推。所以從同位素峰之間的間距，可以推斷出肽段的帶電情況（ z ），從而推斷出肽段的單一同位素質量 [(m/z)*z] 。

13. 哪種離子化方式產生的肽段易帶多個電荷？
在蛋白質組學所涉及的質譜技術中，常見的離子化方式有 MALDI 和 ESI 。目前，對這兩種方法的原理和離子化的具體細節(jié)還沒有一個公認的闡述。但經驗表明， MALDI 所產生的離子化肽段只帶一個電荷（正離子方式）。而 ESI 所產生的離子化肽段往往帶有多個電荷。

14. 單一同位素峰一定是最高的峰嗎？
單一同位素峰一定是一組峰里面質荷比最低的，但不一定是最高的。當肽段的分子量較小時，其所含的原子總數也少，所以整個肽段含有同位素原子的幾率也比較小。這時，單一同位素峰往往是最高的峰。當肽段的分子量增大時，其帶有同位素原子的幾率也隨之增大。在這種情況下，＋ 1 Da ，甚至＋ 2 Da 的同位素峰有可能成為最高峰。統(tǒng)計表明，當肽段的分子量超過 2500 Da 時，最高峰往往不是單一同位素峰。

15. 單一同位素峰的鑒定有什么意義？
單一同位素峰的鑒定對后續(xù)的查庫工作有重要意義。質譜法鑒定蛋白質一般是把得到的質核比數據和數據庫里的數據比對。所以，如果所采集的數據里混有不是單一同位素峰的質量，那么就有可能在查庫時找不到目標蛋白質，或是找到其他的蛋白質，從而嚴重影響比對的效率和真實性。