¹北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；²旭月（北京）科技有限公司，北京100080；

³Vibrating Probe Facility,Biology Department,University of Massachusetts at Amherst,MA 01003,USA

摘要：選擇性微電極技術(shù)是一種不僅能直接測(cè)定活的生物細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)的離子或分子活度，而且能對(duì)活的生物相鄰的位置、功能和代謝速率可能不同的特定微區(qū)細(xì)胞表面的離子或分子流（flux）分別測(cè)定的電生理方法。具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、非入侵性（測(cè)定移動(dòng)速率時(shí)）、靈敏度高（可達(dá)10^-12molescm^-2s^-1）等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)樗�是用微型化（尖端直徑�?/span>0.5~53 μm）的離子或分子選擇性電極直接對(duì)準(zhǔn)樣品測(cè)定，不同于其它化學(xué)測(cè)定需取樣品，所以能連續(xù)測(cè)定和自動(dòng)監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。該文闡述了選擇性微電極測(cè)定原理，總結(jié)了選擇性微電極技術(shù)在植物生理學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并展望了其發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：離子或分子流；離子或分子活度；選擇性微電極技術(shù)；植物

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不斷從環(huán)境中吸收水分和攝取各種礦質(zhì)元素，并進(jìn)行O₂和CO₂等氣體交換。研究人員通常是以植物的器官或組織作為研究對(duì)象，來(lái)了解礦質(zhì)元素、O₂和CO₂等在植物生命過(guò)程中的運(yùn)輸方式、作用機(jī)理。隨著各種微電極的發(fā)展，應(yīng)用微電極對(duì)單個(gè)細(xì)胞或完整植株特定微區(qū)細(xì)胞進(jìn)行研究已經(jīng)成為可能。

離子/分子選擇性微電極是一種連接了電位計(jì)或電流計(jì)后，可以對(duì)溶液中某些特定離子/分子活度給出電位/電流指示的電極。構(gòu)成微電極的材料，已從傳統(tǒng)的玻璃發(fā)展到金屬、高分子聚合物、碳絲、光纖及其它納米材料。20世紀(jì)50年代以來(lái)，隨著離子選擇性微電極的出現(xiàn)和發(fā)展（Hinke 1959；Berman和Hebert 1974；Sykoνά等 1981），離子選擇性微電極也開(kāi)始被用來(lái)研究植物（Bowling 1972）。80年代后，選擇性微電極技術(shù)發(fā)展較快，在動(dòng)物和人體上研究較多，近年來(lái)在植物上的研究報(bào)告越來(lái)越多，有測(cè)定生物體液泡（Walker等 1995）和細(xì)胞質(zhì)（Carden等 2001）中離子的活度的微電極技術(shù)（Carden等 2003）；基于離子/分子選擇性微電極技術(shù)發(fā)展而來(lái)的技術(shù)，即“非損傷微測(cè)技術(shù)”包括如下技術(shù)：1）自參比技術(shù)（Self-Referencing Technolog）（Kühtreiber和Jaffe 1990)； 2）生物體表面離子信息的微電極離子流測(cè)定（microelectrode ion flux measurement，MIFE）技術(shù)（Newman等 1987；Shabala 2000；Newman 2001；Shabala等 2005）；3）掃描離子選擇電極技術(shù)（scanning ion-selective electrode technique, SIET）（Kunkel等 2001；Kunkel等 2005；Vincent等 2005；Xu等 2006）和 4）；還有用于測(cè)定生物體表面分子信息的掃描極譜電極技術(shù)（scanning polarographic electrode technique，SPET）(Kunkel等 2005；Xu等 2006）；因此微電極技術(shù)的最大特點(diǎn)在于，它能準(zhǔn)確地測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或完整植株特定微區(qū)細(xì)胞內(nèi)外離子或分子的活度與流動(dòng)，被用于研究植物對(duì)離子或分子吸收、釋放及跨膜運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。它具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、靈敏度高、非損傷性等特點(diǎn)，而且還可以在電腦控制下連續(xù)測(cè)定與自動(dòng)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了生物體內(nèi)外離子或分子信息的同時(shí)進(jìn)行的實(shí)時(shí)測(cè)定(Kunkel等 2005；Xu等 2006）。

1 選擇性微電極的工作原理

植物細(xì)胞內(nèi)的離子或分子進(jìn)出細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞的內(nèi)外之間會(huì)形成一個(gè)跨膜的電化學(xué)勢(shì)梯度（Δψ_m）。當(dāng)離子選擇微電極置于細(xì)胞或組織表面時(shí)(圖1)，微電極可以對(duì)溶液的離子濃度做出響應(yīng)，由于細(xì)胞可以吸收或釋放離子或分子，與細(xì)胞或組織表面離子或分子的濃度存在著濃度梯度，因此，會(huì)產(chǎn)生離子或分子的擴(kuò)散性移動(dòng)，傳感器產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)放大器的放大輸出到計(jì)算機(jī)，就可以實(shí)時(shí)地檢測(cè)到細(xì)胞或組織表面離子或分子流動(dòng)的變化。計(jì)算離子或分子的移動(dòng)速率，離子擴(kuò)散是可依據(jù)Fick第一定律進(jìn)行計(jì)算（Kühtreiber和Jaffe 1990；Xu等 2006），也可依據(jù)能斯特（Nernst）方程（Newman 2001）計(jì)算。

1.1  依據(jù)Fick定律推導(dǎo)離子移動(dòng)速率  

離子選擇性微電極在待測(cè)離子濃度梯度中對(duì)已知的兩點(diǎn)的距離（dx）進(jìn)行測(cè)定，分別獲得電壓V₁和V₂（圖2）。兩點(diǎn)間的濃度差（dc）從V₁、V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計(jì)算就可以獲得。D是離子或分子特異的擴(kuò)散系數(shù)（單位：cm^-2s^-1），將它們代入Fick的第一擴(kuò)散定律公式：

J_o =-D·dc/dx，可獲得該離子的移動(dòng)速率（J_o，單位為moles·cm^-2·s^-1）。

1.2  依據(jù)能斯特方程推導(dǎo)離子移動(dòng)速率

在測(cè)定開(kāi)始時(shí)，微電極的尖端位于被測(cè)試材料距離x的位置，在距離x處，溶液中離子的電化學(xué)勢(shì)為μ（J/mol）。根據(jù)離子的自由濃度c和電勢(shì)V_b，μ可以根據(jù)如下公式計(jì)算：

 μ=μ_o+RT㏑γc+zFV_b ，式中μ_o為電化學(xué)勢(shì)參考值，z為離子化合價(jià)數(shù)，γ為離子在溶液中的活動(dòng)系數(shù)，F為法拉第常數(shù)（96500 C/mol），R為氣體常數(shù)（8.3 J mol^-1K^-1），T為熱力學(xué)溫度（K）。當(dāng)離子選擇微電極的尖端緩慢移動(dòng)（不攪動(dòng)溶液）一段距離（dx）時(shí)，新位置處的電化學(xué)勢(shì)為μ+dμ，此處的dμ為新位置處的濃度c與電勢(shì)V_b的變化值，而電化學(xué)勢(shì)參考值μ_o不變。標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)理論認(rèn)為，根據(jù)離子濃度c（mol/m）、離子的運(yùn)動(dòng)速度u（m s^-1mol^-1newton^-1）以及電化學(xué)勢(shì)梯度（dμ/dx），就能計(jì)算出離子的凈流量J（mol m^-2s^-1）：

J=cu(dμ/dx)。在電極的內(nèi)部，離子濃度是固定的，因此dμ就表示為內(nèi)部電壓（V）的變化即dV，理想狀態(tài)下dμ= zFdV。V可以用靜電計(jì)測(cè)定，當(dāng)電極移動(dòng)一段距離dx時(shí)，靜電計(jì)測(cè)定值為dV。對(duì)于某一特定離子，u為已知的常數(shù)。因?yàn)?span lang="EN-US">LIX并不總是表現(xiàn)為理想的Nernst行為，實(shí)際測(cè)定的內(nèi)部dV通過(guò)一個(gè)因子g（約接近1.1）降低外部的dμ。因?yàn)檫@個(gè)原因，需要把外部dμ與內(nèi)部測(cè)定的dV聯(lián)系起來(lái)，公式應(yīng)為dμ= zFgdV。因此離子的凈流量J就可由如下公式計(jì)算：

J=cu zFg(dV /dx)。

雖然Newman（2001）是根據(jù)溶液中離子的電化學(xué)勢(shì)（μ）來(lái)推導(dǎo)離子的移動(dòng)速率。但是生物材料實(shí)驗(yàn)證明，離子選擇性微電極的移動(dòng)距離（dx）在幾十微米以下時(shí)，帶電粒子運(yùn)動(dòng)對(duì)電化學(xué)電勢(shì)的影響可以忽略不計(jì)，所以離子的移動(dòng)速率也可以通過(guò)Fick第一擴(kuò)散定律計(jì)算出來(lái)。

應(yīng)用選擇性微電極進(jìn)行植物研究的早期工作主要是測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子活度（Bowling 1972），隨著三維微操縱技術(shù)和電腦軟件控制技術(shù)的發(fā)展，選擇性微電極技術(shù)也得到了快速發(fā)展，現(xiàn)在不僅能測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子活度（Walker等 1995；Carden等 2003），而且還能測(cè)定到活體植物體器官、組織、甚至細(xì)胞表面微量離子以及分子移動(dòng)的速率。

2   在植物營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸研究中的應(yīng)用

選擇性微電極的出現(xiàn)不僅為研究者提供了快速、靈敏地獲得活體植物營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸信息的途徑，而且還能用來(lái)獲得微小區(qū)域不同離子微量的信息。Henriksen和Spanswick（1993）采用NO₃^-微電極研究大麥根對(duì)NO₃^-的吸收情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有用NO₃^-的預(yù)處理才能誘導(dǎo)從0.1 mmol/L的Ca(NO₃)₂中對(duì)NO₃^-的吸收。當(dāng)有NH₄⁺和NO₃^-在一起時(shí)，與無(wú)NH₄⁺的相比，大麥根對(duì)NO₃^-的吸收減少，而對(duì)NH₄⁺的吸收則不受影響(Henriksen等 1990)。對(duì)于NO₃^-和NH₄⁺同時(shí)供給玉米根 (0～3.5 mm)時(shí)，NH₄⁺的凈吸收比NO₃^-的凈吸收高2倍。當(dāng)有100 μmol·L^-1的NH₄⁺時(shí)，玉米分生區(qū)對(duì)NO₃^-的吸收急劇下降，而且在其他區(qū)域下降幅度更大，這說(shuō)明NH₄⁺的存在會(huì)抑制NO₃^-的吸收（Taylor和Bloom 1998）。Colmer和Blomm(1998)用NO₃^-、NH₄⁺微電極考查水稻不定根對(duì)NO₃^-和NH₄⁺的吸收情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)NO₃^-和NH₄⁺在成熟區(qū)、分生區(qū)與伸長(zhǎng)區(qū)的吸收之間有差異，距根尖端的1 mm區(qū)域?qū)?span lang="EN-US">NO₃^-和NH₄⁺的吸收速率都大，NH₄⁺的吸收速率高于NO₃^-的吸收速率；相反，在含有厚壁組織纖維的水稻不定根的基部區(qū)域（距根尖端21 mm之外），NO₃^-和NH₄⁺的吸收速率明顯較低，因此作者認(rèn)為厚壁組織的纖維限制了根對(duì)NO₃^-和NH₄⁺的吸收。同樣，我們實(shí)驗(yàn)室用H⁺、K⁺微電極研究沙冬青的幼根不同區(qū)域在鹽脅迫下H⁺和K⁺的進(jìn)出速率情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)其根冠（0~500 μm）和分生區(qū)（500~2500 μm）H⁺、K⁺的外流量也都較基部（大于2.5 mm之外）大得多。選擇性微電極測(cè)定得到的結(jié)果可以說(shuō)明，根冠和分生區(qū)是吸收營(yíng)養(yǎng)元素的關(guān)鍵部位。

植物體內(nèi)硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)可明顯改善植株的生長(zhǎng)發(fā)育。我國(guó)學(xué)者用NO₃^-微電極測(cè)定了小白菜、水稻活體細(xì)胞中NO₃^-的活度(賈莉君等 2005a，b；尹曉明等 2005)，因此，NO₃^-微電極的使用可以為選育氮素高效吸收的植物品種提供電生理指標(biāo)。

鉀是大多數(shù)植物活動(dòng)細(xì)胞中含量最高的無(wú)機(jī)元素，鉀在碳水化合物代謝、呼吸作用及蛋白質(zhì)代謝中起重要作用。另外，鉀離子還是調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)、平衡膜電位的最重要組分。鉀離子進(jìn)入還是逸出植物根系表面與外界環(huán)境中鉀離子的濃度有關(guān)。當(dāng)植物根尖處于低鉀（<10 μmol/L）溶液中時(shí)，用K⁺微電極可測(cè)到K⁺會(huì)從根的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)流出，從而使所處溶液中的K⁺濃度到50 μmol/L（Newman等 1987；Ryan等 1990，1992）。Ryan等(1992)用Cl^-微電極研究小麥對(duì)鋁敏感和耐鋁品種根內(nèi)Cl^-的流動(dòng)時(shí)，觀察到在小麥根處于0.1 mmol/L的CaC1₂(pH4.5)介質(zhì)中時(shí)，Cl^-大量地從分生區(qū)流人介質(zhì)中。

以上研究結(jié)果充分表明，選擇性微電極這種能直接并靈敏地反映植物體特定微區(qū)（>um）對(duì)礦質(zhì)元素的需求的測(cè)試工具，一方面可供研究者進(jìn)行某種離子高或低吸收的植物品種篩選，另一方面可供研究者制定出與植物需求相適應(yīng)的環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平。

3        在植物生長(zhǎng)發(fā)育研究中的應(yīng)用

光通過(guò)光周期和非光周期過(guò)程影響著葉片的展開(kāi)。選擇性微電極能探測(cè)到光誘導(dǎo)引起的與葉片生長(zhǎng)有關(guān)的離子或分子信息。Zivanovic等（2005）利用選擇性微電極比較了白光（2600 μmol·m^-2·s^-1）下及結(jié)合使用DCMU后的玉米葉片不同區(qū)域（葉基部和葉頂部）的H⁺、K⁺和Ca²⁺流量，結(jié)果表明，去表皮葉片的葉基部和葉頂部離子流量無(wú)顯著差異，留表皮的葉片的葉基部和葉頂部離子流量有顯著差異，并推測(cè)，光誘導(dǎo)引起的葉表皮K⁺流（動(dòng)）是葉片展開(kāi)必需的，葉肉細(xì)胞K⁺流的變化可能只是起著平衡電荷的作用；光誘導(dǎo)的Ca²⁺內(nèi)流既不直接引起葉片展開(kāi)，也不直接貢獻(xiàn)光合行為表現(xiàn)。該研究表明，選擇性微電極探測(cè)到的光引起離子流的變化既與葉片生長(zhǎng)相聯(lián)系，也與光合作用有關(guān)。更有趣的是，Shabala和Newman（1997a）用H⁺、Ca²⁺微電極研究玉米根不同區(qū)域的回旋轉(zhuǎn)頭運(yùn)動(dòng)（circumnution）與H⁺、Ca²⁺的流動(dòng)關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)根伸長(zhǎng)區(qū)的H⁺流動(dòng)與玉米根的回旋轉(zhuǎn)頭運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切。認(rèn)為H⁺流的振動(dòng)（oscillation）可能參與了根的回旋轉(zhuǎn)頭運(yùn)動(dòng)。

菌根是土壤中特有的真菌與植物根的共生聯(lián)合體。植物有了菌根，就可以通過(guò)無(wú)數(shù)細(xì)長(zhǎng)菌絲和菌索吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)和水分，擴(kuò)大根系的吸收面積，提高吸收能力。選擇性微電極可直接置于植物活的外生菌根（ectomycorrhizae）表面，研究單個(gè)菌根對(duì)不同離子吸收或釋放的情況（Plassard等 2002）。這為在含有不同離子的土壤上種植喜好該土壤中離子的菌根植物，提供了一種方便快捷的方法。由此看來(lái)，微電極技術(shù)還可以用來(lái)研究不同生活習(xí)性的植物根系對(duì)離子吸收的嗜好，為不同植物種植于不同離子含量的土壤中提供理論依據(jù)。

近幾年，選擇性微電極技術(shù)發(fā)展較快，除了能用于測(cè)定植物體H⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cl^-、NO₃^-、NH₄⁺、Cd²⁺（Piñeros等 1998）、Mg²⁺（Shabala和Hariadi 2005）離子信息，還能測(cè)定O₂信息(Xu等 2006；Pang等 2006；Shabala等 2006）。如，Xu等（2006）利用H⁺微電極和O₂極譜電極同時(shí)測(cè)定了百合花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中H⁺和O₂進(jìn)出的變化。結(jié)果表明，在花粉管堿化區(qū)域的H⁺表現(xiàn)為外流，而O₂表現(xiàn)為內(nèi)流，因此，推測(cè)花粉管堿化區(qū)域有豐富的活躍的線粒體。

上述研究結(jié)果充分說(shuō)明，選擇性微電極技術(shù)能單獨(dú)地用來(lái)有效測(cè)定植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所需的各種礦質(zhì)元素、H⁺、O₂等的含量和它們之間的關(guān)系，這對(duì)人們研究植物根系的生長(zhǎng)及其對(duì)土壤中各種營(yíng)養(yǎng)元素的吸收過(guò)程提供了一個(gè)極為有效的手段。

4   在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用

Ca²⁺是植物活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的重要第二信使，通過(guò)許多種依賴鈣的調(diào)節(jié)蛋白和功能蛋白，鈣信使幾乎在植物細(xì)胞的所有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。觸摸、病原物侵染、植物激素、逆境(包括鹽脅迫、氧化脅迫、低溫、高溫、干旱等)均能引起胞內(nèi)Ca²⁺水平改變。這種變化通過(guò)啟動(dòng)胞內(nèi)生理生化過(guò)程，起著傳遞和放大信號(hào)的作用(Bush 1995)。

Bjorkman和Cleland(1991)采用Ca²⁺微電極測(cè)定玉米根尖表面Ca²⁺的流（動(dòng)），發(fā)現(xiàn)在受重力刺激的根尖內(nèi)外存在一個(gè)Ca²⁺梯度。該Ca²⁺梯度似乎具有信號(hào)傳遞功能。隨著Ca²⁺微電極技術(shù)的不斷應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)Ca²⁺流（動(dòng)）還涉及到植物對(duì)各種環(huán)境脅迫的反應(yīng)。如，Huang等（1992）認(rèn)為Al³⁺能抑制對(duì)Al³⁺敏感小麥品種對(duì)Ca²⁺的吸收，而不抑制耐Al³⁺小麥品種對(duì)Ca²⁺的吸收。Halperin等（1997）發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下大麥根尖對(duì)Ca²⁺的吸收下降，而其他區(qū)域則不下降。Vincent等（2005）比較了野生型和突變體擬南芥根毛外部Ca²⁺的流（動(dòng)）情況，發(fā)現(xiàn)缺失AtSfh1p的根毛的Ca²⁺信號(hào)傳遞異常。Felle等（2000）利用Ca²⁺和H⁺微電極考查(GlcNAc)_n和Nod factors對(duì)苜蓿(Medicago sativa subsp. sativa cv Sitel)根毛細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺和H⁺活度的變化及細(xì)胞防御反應(yīng)的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)(GlcNAc)_n和Nod factors與根毛共生及防御相關(guān)的信號(hào)感受位點(diǎn)不同，而且由它們引起的胞內(nèi)Ca²⁺活性或者pH的變化及其下游響應(yīng)也不一樣。

Shabala和Newman(1997b)用H⁺微電極測(cè)定了對(duì)驟冷敏感的黃瓜、南瓜，不敏感的豌豆，蠶豆及中度敏感的玉米等5種作物根表面H⁺的運(yùn)輸情況，觀察到經(jīng)過(guò)4℃冰箱冷脅迫處理1.5 hr的植物根系表面的H⁺，開(kāi)始幾分鐘都表現(xiàn)為外流，只是耐冷的豌豆和蠶豆的H⁺外流持續(xù)時(shí)間短些（3~4 min），而冷敏感的黃瓜和南瓜的H⁺外流持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（8~12 min），而且耐冷的豌豆和蠶豆的ACT1（associated with H⁺ minimum）和ACT2（associated with H⁺ maximum）顯著的低于冷敏感的黃瓜和南瓜的。并認(rèn)為離子流(動(dòng))的進(jìn)一步研究也許能指明胞內(nèi)感受驟冷脅迫的位點(diǎn)及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

Hanstein和Felle(2002)用Cl^-微電極研究觀察了CO₂對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞及其質(zhì)外體中的Cl^-活性。結(jié)果表明，CO₂濃度從350 μl/L增至600 μl/L時(shí)，質(zhì)外體的Cl^-活性在10 min內(nèi)就從3 mmol·L^-1增加到14 mmol/L，這表明大量Cl^-從保衛(wèi)細(xì)胞流出。這種Cl^-反應(yīng)與關(guān)閉光源所引起的Cl^-外流相似。CO₂引起的Cl^-外流暗示有一個(gè)來(lái)源于CO₂的中間效應(yīng)器，它能激活保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)膜上的陰離子通道，從而引起Cl^-外流。Tegg等（2005）利用非損傷離子流測(cè)定技術(shù)探測(cè)到了植物組織（根、花粉管）因使用thaxtomin A（一種植物毒素）而引起的Ca²⁺和H⁺流量變化，并認(rèn)為具有組織特異性的Ca²⁺、H⁺流量的快速變化，是thaxtomin A引發(fā)的早期信號(hào)，是植物感知病原體的關(guān)鍵方式。

上述結(jié)果說(shuō)明，超靈敏的選擇性微電極可以應(yīng)用于離子的極微量變化的信號(hào)探測(cè)。

5   在植物逆境生理研究中的應(yīng)用

隨著選擇性微電極技術(shù)的日益成熟，近年來(lái)，許多學(xué)者開(kāi)始用選擇性微電極探討植物適應(yīng)逆境的離子或分子流的瞬間變化（我們稱之為原初響應(yīng)機(jī)制）。Shabala（2000）考察了蠶豆葉片葉肉細(xì)胞在鹽脅迫和滲透脅迫下離子流的響應(yīng)機(jī)制，觀察到90mM NaCl會(huì)導(dǎo)致K⁺出現(xiàn)明顯的外流，促進(jìn)H⁺泵活性，但是當(dāng)測(cè)定液中含有10mM Ca²⁺時(shí)，上述現(xiàn)象就不發(fā)生。然而Na⁺流無(wú)論在高Ca²⁺或低Ca²⁺的測(cè)定液中，變化都不明顯。相反地是，蠶豆葉片在150mM 甘露醇（相當(dāng)于-0.38 MPa）下，K⁺出現(xiàn)明顯的內(nèi)流。因此，Shabala認(rèn)為蠶豆葉參與感知鹽分和滲透脅迫的離子響應(yīng)機(jī)制是不同的。而且他們還發(fā)現(xiàn)，所處測(cè)定液的離子組成的變化并不會(huì)改變滲透脅迫(150mM 甘露醇)引起葉肉細(xì)胞K⁺、Cl^-顯著的增加（Shabala等，2000）。另外，shabala等（2002）把選擇性微電極技術(shù)和壓力探針技術(shù)結(jié)合起來(lái)，直接觀察到了滲透脅迫時(shí)擬南芥根表皮細(xì)胞膨壓變化與離子移動(dòng)之間的關(guān)系，實(shí)時(shí)地證明了滲透脅迫一開(kāi)始，細(xì)胞膨壓立即從0.65 MPa降低到大約0.25 MPa。當(dāng)脅迫2~10 min左右時(shí)，細(xì)胞膨壓開(kāi)始恢復(fù)，而且此時(shí)伴隨著K⁺、Na⁺、Cl^-的顯著內(nèi)流(30~80 nmolm^-2s^-1)，并認(rèn)為細(xì)胞膨壓的快速恢復(fù)主要是由于滲透脅迫引起大量K⁺、Na⁺、Cl^-調(diào)入細(xì)胞，從而加大吸水能力。

Carden等（2003）在測(cè)定200 mmol/LNaCl脅迫下小麥根內(nèi)Na⁺、K⁺、H⁺活度的變化時(shí)，將微電極分別插入根皮層細(xì)胞的胞質(zhì)里和液泡里，測(cè)定了這兩部分Na⁺等離子在200 mmol/LNaCl脅迫下第5、8天發(fā)生的變化。結(jié)果表明，NaC1脅迫處理后的第5天，大麥耐鹽品種‘Gerbel’和鹽敏感品種‘Triumph’根皮層細(xì)胞胞質(zhì)都具有較高K⁺活度，而細(xì)胞胞質(zhì)中的Na⁺活度則是鹽敏感品種明顯高于前者；NaC1脅迫處理第8天，耐鹽品種根細(xì)胞胞質(zhì)仍能維持高K⁺活度，而鹽敏感品種的K⁺活度下降，Na⁺活度則‘Gerbel’細(xì)胞胞質(zhì)中高于‘Triumph’。Pang等（2006）用選擇性微電極研究了耐澇大麥與澇敏大麥在水澇（即氧不足）條件下，大麥根三個(gè)區(qū)域表面的H⁺、K⁺、O₂流（動(dòng)）。發(fā)現(xiàn)澇敏大麥‘Naso Nijo’在氧不足時(shí)，其根成熟區(qū)表面的K⁺內(nèi)流量急劇變小，而耐澇大麥‘TX9425’K⁺內(nèi)流量幾乎未發(fā)生變化。

當(dāng)用選擇性微電極進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)時(shí)，還可以觀察到植物體的離子或分子流呈現(xiàn)一定的次晝夜節(jié)律性波動(dòng)變化。Shabala等（2006）用H⁺、K⁺、Ca²⁺、O₂微電極分別考查了多種植物及同一植物不同部分（燕麥胚芽鞘原生質(zhì)體、番茄花粉管、原生生物細(xì)胞、玉米幼根分生區(qū)、玉米葉表皮）的H⁺、K⁺、Ca²⁺、O₂流（動(dòng)）。觀察到H⁺、K⁺、O₂流（動(dòng)）具有內(nèi)生的波動(dòng)節(jié)律性變化，Ca²⁺流（動(dòng)）卻沒(méi)有波動(dòng)，而且H⁺、K⁺、O₂流次晝夜節(jié)律性波動(dòng)的周期會(huì)隨著環(huán)境溫度、氧濃度、試驗(yàn)植株生長(zhǎng)的基液的化學(xué)組成、鹽和滲透脅迫的變化而變化；跨膜的H⁺流的波動(dòng)周期隨著試驗(yàn)植株所處的基液中K⁺、NaCl濃度的升高而增大，隨著環(huán)境溫度上升而減�。�O₂流的次晝夜節(jié)律性波動(dòng)隨著環(huán)境溫度下降、氧不足而變慢。

上述研究充分說(shuō)明，選擇性微電極技術(shù)可以及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)到活體植物離子或分子信息因環(huán)境變化而引起的微量變化。因此，該技術(shù)可能成為最靈敏、最直觀、能實(shí)時(shí)反映逆境脅迫后植物的生理指標(biāo)測(cè)定方法之一。

6  選擇性微電極技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與局限

選擇性微電極技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)，是在保持被測(cè)植物樣品完整（即不造成任何損傷）和接近實(shí)際生理狀態(tài)環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定，并能實(shí)時(shí)、連續(xù)地獲得進(jìn)出活體植物組織、器官、單個(gè)細(xì)胞甚至細(xì)胞器內(nèi)特定離子或分子活度計(jì)移動(dòng)速率。雖然膜片鉗技術(shù)也能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物生物膜離子通道的離子（電）流(ion current)變化，但是它只能用于研究脫去細(xì)胞壁后的生物膜的離子通道（電）流（許越和邱澤生 1993；朱俊英等 2006），使得它在植物上很難廣泛應(yīng)用。當(dāng)然，現(xiàn)在也有研究者把選擇性微電極技術(shù)與膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來(lái)，同時(shí)監(jiān)測(cè)生物膜的離子流（動(dòng)）（ion flux）和離子（電）流（Tyerman等 2001；Gilliham等 2006），這為實(shí)時(shí)探明不同環(huán)境下生物膜離子通道、載體或泵活性的變化提供了很好的研究平臺(tái)。選擇性微電極技術(shù)與膜片鉗技術(shù)及常規(guī)技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，上述3種方法在測(cè)定離子流時(shí)的差異見(jiàn)表1。

當(dāng)然，目前選擇性微電極技術(shù)也有制作困難，且不易保存，離子載體或LIX的選擇性系數(shù)不理想（Knowles和Shabala 2004），且選擇性微電極所測(cè)到的電位與溶液的濃度并不總是呈現(xiàn)理想的能斯特斜率（Nernstian slope），另外膨脹狀態(tài)的植物細(xì)胞及其細(xì)胞壁，容易損壞微電極的尖端(Felle 1989)，因此在一定程度上也限制了其應(yīng)用的范圍。

7  展望

選擇性微電極技術(shù)能用于直接并靈敏地觀察植物體對(duì)礦質(zhì)元素的需求，研究者可利用選擇性微電極技術(shù)進(jìn)行對(duì)植物某種離子或高或低的吸收的品種的篩選，還可制定出與植物需求相適應(yīng)的環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)水平；能及時(shí)準(zhǔn)確地探測(cè)到的光、溫、水澇、鹽分引起的植物體離子或分子信息的微小變化，能成為預(yù)測(cè)植物受到逆境脅迫最直觀、最靈敏的生理指標(biāo)測(cè)定方法之一；超靈敏的選擇性微電極可以應(yīng)用于信號(hào)傳遞過(guò)程中有關(guān)離子或分子的微量變化的信號(hào)探測(cè)；還可用于基因組后期研究所面臨的那些未知的或者人工表達(dá)的蛋白質(zhì)功能的研究鑒定，等等。

近年來(lái)，在分析化學(xué)上對(duì)離子選擇電極取得了很大進(jìn)展，測(cè)定下限得到了很大提高，如Ca²⁺等可以達(dá)到10^-9 mol/L水平（Michalska 2006），以及光纖維微電極的發(fā)展（Wolfbeis 2006）、納米微粒傳感器的進(jìn)展，特別是碳纖維微電極伏安法的進(jìn)展為細(xì)胞生物化學(xué)物質(zhì)的交換等研究產(chǎn)生重大影響。選擇性微電極技術(shù)在測(cè)定植物體內(nèi)信號(hào)物質(zhì)（如NO、H₂O₂、CO），磷酸鹽和Cu²⁺、Zn²⁺等微量元素也取得一些新的進(jìn)展(Bakker和Qin 2006)，使該方法在植物生理上的研究日益完善。

總之，由于選擇性微電極技術(shù)是非損傷性地分別記錄活體植物細(xì)胞表面的離子或分子移動(dòng)的原初響應(yīng)機(jī)制，能讓研究者在真正意義上實(shí)現(xiàn)與活體植物器官不同細(xì)胞的直接對(duì)話，能讓研究者實(shí)時(shí)了解植物體隨環(huán)境變化發(fā)生的變化及植物（細(xì)胞）所做出的反應(yīng)誘發(fā)所做出的反應(yīng)的原因。隨著旭月（北京）科技有限公司將“非損傷微測(cè)技術(shù)”引進(jìn)到國(guó)內(nèi)，選擇性微電極理論研究的深入和探測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，必將更準(zhǔn)確、更全面地揭示植物體離子、分子信息與植物特定功能之間的關(guān)系，為國(guó)內(nèi)植物生理研究者揭示植物體內(nèi)在的生命活動(dòng)規(guī)律提供較好的技術(shù)手段。

致謝：北京林業(yè)大學(xué)尹偉倫院士對(duì)本文的熱情支持和指導(dǎo)。

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Application of Selective Microelectrode in Plant Physiological Research

ZHU Jun-Ying¹, GAO Rong-Fu ¹, XU Yue^2,3*

¹College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; ²Xu-Yue(Beijing)Science & Technology Company Limited, Beijing 100080; ³Vibrating Probe Facility, Biology Department, University of Massachusetts at Amherst, MA 01003, USA

Abstract: Selective microelectrode technique, known as an electrophysiological approach, can be used to measure directly specific information on ion or molecule distribution and movement both inside and outside of living organelle, biological cells, tissue and organs. It has several advantages over other methods in measuring ionic or molecular information, e.g. easy to handle, fast response, high sensitivity (10^-12 molcm^-2s^-1) and non-invasive to the samples in addition to continuous measurement and automatic monitoring. Microscopic-scale selective electrode (with a tip diameter of 0.5~3 μm）can be used to measure net fluxes of ions or molecules outside of growing biological cells, tissues and organs, to measure both activities of ions or molecules and membrane potential inside of growing organelle and biological cells.Thus, it has many applications in various research fields.The technical principle of design and use of selective microelectrode and its progress and development prospect in plant physiological research are summarized.

Key words：ionic fluxes; molecular fluxes; ionic activity; molecular activity; selective microelectrode; plant

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.30371143&30571472）

*Corresponding author(E-mail: yue@xu-yue.com, Tel: 86-10-82622628)