印莉萍¹    上官宇²    許越^{2 *}

 

1.    首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 北京 100037; 2.Younger USA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA;)

 

摘要  各種分子和離子進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程對(duì)于維持植物體自身的活性至關(guān)重要.非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)(Scanning Ion-selective Electrode Technique,SIET)在不接觸被測(cè)生物樣品－即在保持被測(cè)生物樣品完整和近乎實(shí)際生理環(huán)境的狀態(tài)下，獲得進(jìn)出樣品的各種分子和離子的信息.該技術(shù)不僅能夠測(cè)量離子及分子靜止?fàn)顟B(tài)下的絕對(duì)濃度，而且還可以測(cè)量它們進(jìn)出生物樣品的運(yùn)動(dòng)速率及運(yùn)動(dòng)方向.SIET可以圍繞被測(cè)的單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞、組織甚至器官進(jìn)行靈活、方便而準(zhǔn)確的立體測(cè)量并獲得被測(cè)物體周圍的離子或分子的三維立體數(shù)據(jù).目前，SIET不但可以分別測(cè)量H⁺,Ca²⁺,K⁺,Al³⁺,Cd²⁺,Cl^-和O₂，CO₂，NO及溫度等參數(shù)，而且可以同時(shí)采集多種離子及參數(shù)，為獲得生物樣品內(nèi)外分子或離子運(yùn)動(dòng)的有關(guān)信息提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái).

關(guān)鍵詞 非損傷性電生理技術(shù) 離子選擇性電極 離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) SIET

 對(duì)于跨膜的離子分子活性和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究始終是植物分子生理學(xué)研究的一個(gè)重要方面.特別是在基因組研究后期所面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)就是如何理解和確認(rèn)那些未知的或者人工表達(dá)的蛋白質(zhì)功能，特別是細(xì)胞質(zhì)膜上的離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，以及由這些蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的眾多信息是如何被細(xì)胞正確地整合到一起的.非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)(Scanning IonSelective Electrode Technique, SIET)作為一個(gè)綜合性較強(qiáng)的電生理技術(shù)成為迎接這一挑戰(zhàn)的理想工具.

SIET 技術(shù)的核心是離子和分子選擇性微電極(以下簡(jiǎn)稱：離子電極)(圖1)，由Kühtreiber和 Jaffe^[1]設(shè)計(jì)的一套由計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)定位測(cè)量系統(tǒng)演變發(fā)展而成.在計(jì)算機(jī)控制、信號(hào)放大和三維測(cè)量方面做了較大的改進(jìn)^[2].由于SIET能夠以非損傷的方式測(cè)量到進(jìn)出生物材料的離子以及分子的運(yùn)動(dòng)速率，并隨著離子/分子電極種類的不斷增多以及電子線路技術(shù)和計(jì)算機(jī)硬件軟件的逐步完善，SIET逐漸被應(yīng)用到基礎(chǔ)生物學(xué)、生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、空間生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)分子生理學(xué)、農(nóng)林學(xué)及藥物機(jī)理研究等領(lǐng)域^[3，4].

盡管人們通過(guò)膜電壓的測(cè)量，如膜片鉗技術(shù)^[5，6]，及與顯微技術(shù)相結(jié)合的熒光染料技術(shù)，獲得了一些有關(guān)離子分布和運(yùn)動(dòng)的情況，但是，SIET技術(shù)作為對(duì)上述幾項(xiàng)技術(shù)的重要補(bǔ)充，并以其特有的時(shí)間和空間分辨率，為鑒定或驗(yàn)證某些生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能提供了非常有力的工具.在這篇綜述里，我們將介紹SIET的基本原理、方法及其在高等植物細(xì)胞研究中的應(yīng)用.

圖1 離子選擇性電極和SIET的時(shí)間和空間分辨率分布

(a)Ca²⁺微電極的顯微照片，由液體離子交換劑(LIX)和電解質(zhì)組成；(b)圖中A表示通過(guò)染料標(biāo)記或膜片鉗等局部研究方法的時(shí)空分辨率；B表示整體組織研究過(guò)程中通過(guò)較慢的化學(xué)痕量方法的時(shí)空分辨率；而SIET作為一個(gè)開(kāi)放式的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，較好地填補(bǔ)了較慢的化學(xué)痕量方法與較快的染料標(biāo)記或膜片鉗等方法兩者之間的技術(shù)空白.

　

1 SIET 原理

1.1物理學(xué)及數(shù)學(xué)基礎(chǔ)

物質(zhì)在液體環(huán)境中有從高濃度到低濃度擴(kuò)散的趨勢(shì).對(duì)于帶電粒子而言，還有從高電化學(xué)電勢(shì)到低的電化學(xué)電勢(shì)運(yùn)動(dòng)的趨勢(shì).如果，離子電極的移動(dòng)距離dx在幾十微米以下，生物材料實(shí)驗(yàn)證明，影響帶電粒子運(yùn)動(dòng)的電化學(xué)電勢(shì)的梯度可以忽略不計(jì)，那么，該離子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速率可以通過(guò)Fick
第一擴(kuò)散定律計(jì)算出來(lái)^[7] (圖2).

圖2以Ca²⁺濃度梯度和Ca²⁺微電極為例說(shuō)明SIET的物理學(xué)及數(shù)學(xué)原理

 

離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導(dǎo)線、電解質(zhì)(100mmol/L CaCl₂)及液態(tài)離子交換劑(LIX) 4部分組成.該電極在待測(cè)離子濃度梯度中以已知距離dx進(jìn)行兩點(diǎn)測(cè)量，并分別獲得電壓V₁V₂.兩點(diǎn)間的濃度差dc則可以從V₁，V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計(jì)算獲得.D是離子/分子特異的擴(kuò)散常數(shù)(單位:cm^-2sec^-1)，將它們代入Fick的第一擴(kuò)散定律公式： J_o= - D * dc/dx ，可獲得該離子的移動(dòng)速率(單位：pmol cm^-2sec^-1)，即：每一秒鐘通過(guò)一個(gè)平方厘米的該離子/分子摩爾數(shù) .

液態(tài)離子交換劑是基于大型中性分子載體的一類有機(jī)化合物.目前可以購(gòu)買得到一些常見(jiàn)的LIX.有些研究人員根據(jù)自己的需要還自行開(kāi)發(fā)特殊的LIX，其他的種類還在不斷的開(kāi)發(fā)中. 

1.2計(jì)算機(jī)技術(shù)及系統(tǒng)集成

SIET的誕生、發(fā)展與完善與計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步是密不可分的^[2,8] .盡管計(jì)算機(jī)需要同時(shí)控制三維運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、顯微成像系統(tǒng)和信號(hào)放大系統(tǒng)3個(gè)子系統(tǒng)，但由于離子選擇電極相對(duì)較低的時(shí)間分辨率要求，使得普通的個(gè)人計(jì)算機(jī)也可以完全勝任.這為SIET的普及和發(fā)展提供了很好的基礎(chǔ). 

1.3 SIET的緩沖溶液

在使用SIET技術(shù)過(guò)程中，通常要在溶液中加入一些緩沖劑成份，如：MES，Tris或EDTA 等，用以穩(wěn)定被測(cè)離子以便離子選擇電極進(jìn)行測(cè)量^[9-12] .然而，如果離子緩沖劑選擇或者使用不當(dāng)，被測(cè)離子會(huì)與緩沖劑相互干擾，破壞被測(cè)離子的濃度梯度或者被大幅度壓縮，從而嚴(yán)重影響到SIET的應(yīng)用效果.Kunkel 等通過(guò)系統(tǒng)的比較試驗(yàn)，尋找到了一些最適合SIET
技術(shù)的溶液pH 緩沖劑及其使用方法，并以實(shí)際生物材料的研究證明通過(guò)使用這些方法可以將SIET測(cè)知離子流動(dòng)速率的能力達(dá)到最大化^[13].因此，在SIET
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，不但要考慮到測(cè)量溶液中各種成份對(duì)被測(cè)樣品生物活性的影響，還要充分考慮到緩沖劑成份對(duì)被測(cè)離子梯度的作用以及對(duì)液態(tài)離子交換劑（LIX）有無(wú)嚴(yán)重干擾.

1.4 SIET測(cè)量的空間幾何構(gòu)型

現(xiàn)有的1-2m微米直徑的離子電極，在電極距被測(cè)材料2-20
μm及dx在5-30μm的技術(shù)條件下，被測(cè)材料離子流動(dòng)的空間幾何分布可以大致分為3類：點(diǎn)、平面及球體.在離子電極距被測(cè)材料小于5μm時(shí)，通常認(rèn)為離子以平面方式運(yùn)動(dòng).

值得一提的是，SIET是目前世界上惟一能夠按照研究人員的設(shè)定，以手動(dòng)或編程的方式，從任意角度(相對(duì)于被測(cè)物體表面)用離子選擇電極對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)量的系統(tǒng).利用SIET靈活的空間測(cè)量方式的經(jīng)典的例子是對(duì)植物花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，尖端Ca²⁺內(nèi)流的研究^[13]. Kunkel 等發(fā)現(xiàn)花粉管的生長(zhǎng)與Ca²⁺內(nèi)流密切相關(guān)，只有在花粉管尖端迅速生長(zhǎng)的部位才能檢測(cè)到Ca²⁺內(nèi)流速度.已經(jīng)伸長(zhǎng)成熟的花粉管，幾乎檢測(cè)不到Ca²⁺內(nèi)流速率.人們不但能夠測(cè)量出Ca²⁺的內(nèi)流速率，而且還計(jì)算出該花粉管尖端一個(gè)圓盤式的結(jié)構(gòu)是Ca²⁺進(jìn)入細(xì)胞的區(qū)域(Cardenas等 1999).

2 SIET 的應(yīng)用

SIET誕生和發(fā)展是在植物學(xué)研究中實(shí)現(xiàn)的.這可能與植物細(xì)胞外的細(xì)胞壁對(duì)膜片鉗技術(shù)來(lái)講操作較為困難有關(guān).而利用SIET特有的非損傷性特點(diǎn)，可以在不對(duì)細(xì)胞、組織甚至器官造成任何損傷的情況下測(cè)知離子分子的轉(zhuǎn)運(yùn)情況.正是意識(shí)到SIET的這一優(yōu)勢(shì)， Kochian 等在原有的Ca²⁺選擇微電極的基礎(chǔ)上，又相繼開(kāi)發(fā)出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺離子選擇性電極，將其應(yīng)用于玉米根和植物毒理學(xué)的研究，并為這些電極在動(dòng)物研究中的應(yīng)用開(kāi)辟了道路^[15-17].隨后，SIET技術(shù)被應(yīng)用于整體根、根毛及花粉管的研究，并闡明了諸如鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)與樣品內(nèi)部活動(dòng)及生長(zhǎng)的相關(guān)性^{[14，18-24]}.Messerli等應(yīng)用SIET技術(shù)將脈動(dòng)式的花粉管生長(zhǎng)所體現(xiàn)的周期與離子流動(dòng)速率表現(xiàn)出的頻率相互聯(lián)系起來(lái). ^[25]

2.1離子與分子流動(dòng)的同時(shí)測(cè)量證明了花粉管堿化帶的存在

Hepler等發(fā)現(xiàn)不斷生長(zhǎng)的百合花粉管前端存在有一個(gè)堿化帶，之后他們提出該堿化帶可能是由于區(qū)域的線粒體的密集存在所致^[23].許越等應(yīng)用SIET特有的雙電極同時(shí)測(cè)量功能，發(fā)現(xiàn)H⁺離子的外流和O₂分子的內(nèi)流是引起該堿化區(qū)的主要原因.花粉管的生長(zhǎng)需要大量的能量，能量來(lái)源于線粒體的氧化磷酸化. O₂分子的內(nèi)流，伴隨H⁺離子的外流是形成能量的主要驅(qū)動(dòng)力.也正是由于H⁺離子的外流造成了花粉管前端局部的堿化帶，從而證明Hepler等的假說(shuō)是正確的(圖3)

圖3
H⁺和O₂ 流動(dòng)速率的同時(shí)測(cè)量.

(a)顯微照片顯示金屬氧電極與玻璃H⁺電極同時(shí)測(cè)量百合花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中H⁺離子和O₂分子進(jìn)出的變化；(b)在花粉管線粒體密集區(qū)域,
或稱固有堿化帶區(qū)域，同時(shí)存在的H⁺外流和O₂內(nèi)流現(xiàn)象.

 

 

2.2 SIET與熒光顯微技術(shù)結(jié)合證明磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與根毛發(fā)生有關(guān)

Vincent 等在鑒定出擬南芥磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族 (PITPs)的一種成份AtSfh1p 之后，將顯微熒光技術(shù)與SIET
結(jié)合，從細(xì)胞的內(nèi)部和外部同時(shí)證明AtSfh1p 在根毛頂端生長(zhǎng)過(guò)程中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜磷酸肌醇極性運(yùn)輸、Ca²⁺信號(hào)傳遞和細(xì)胞骨架的功能.在植物細(xì)胞的極性生長(zhǎng)機(jī)理研究方面向前推進(jìn)了一步.

擬南芥缺失根毛突變體（AtSfh1p）不僅在根毛形態(tài)上有變化，不規(guī)則彎曲，失去重力極性；而且在Ca²⁺信號(hào)傳遞方面也有異常^[26].
利用Ca²⁺熒光顯微技術(shù)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)部Ca²⁺濃度梯度，而利用SIET可測(cè)得外部Ca²⁺流動(dòng)情況.結(jié)果表明野生型的根毛只有在生長(zhǎng)旺盛的頂尖區(qū)，Ca²⁺的內(nèi)流速度快，而突變株的根毛Ca²⁺流動(dòng)的方向和大小明顯不同于野生型的根毛.非重力方向的根毛，四周表面都可以檢測(cè)到Ca²⁺的內(nèi)流，而且流速高于野生型的兩倍左右. ^[26]

 2.3 多離子電極的同時(shí)應(yīng)用證明Ca²⁺及H⁺在植物感知重力變化中起作用

美國(guó)北卡羅來(lái)納州立大學(xué)植物系NSCORT
研究組受美國(guó)宇航局資助，研究植物感知重力的遺傳及生理機(jī)理，通過(guò)對(duì)重力非敏感的擬南芥突變體的研究，許越等發(fā)現(xiàn)植物根部在相對(duì)于地球重力不同的位置的情況下，其H⁺和Ca²⁺的流動(dòng)在根部的不同位置呈現(xiàn)出不同的變化，顯示出及H⁺和Ca²⁺可能在植物感知重力變化的過(guò)程中扮演一定的角色(圖4)
^[6].

圖4
利用SIET 對(duì)重力非敏感植物突變體Ca²⁺及H⁺變化的同時(shí)測(cè)量.

(a)擬南芥突變體（ARG）及其野生型擬南芥（WS)；(b)ARG在重力變化刺激下的 Ca²⁺及H⁺變化與野生型對(duì)照有明顯的區(qū)別.

 

3 總結(jié)及展望

經(jīng)過(guò)多年的改進(jìn)，SIET數(shù)據(jù)的生成、采集以及校準(zhǔn)等方面不斷得到完善.特別是應(yīng)用SIET
強(qiáng)大的三維立體測(cè)量方式，研究人員可以獲得其他電生理技術(shù)無(wú)法測(cè)到的被測(cè)樣品某些點(diǎn)的特異活性^[8，27-29]. SIET 是一個(gè)與膜片鉗^[30]無(wú)論在時(shí)間分辨率還是在空間分辨率上都不相同的技術(shù)，但兩者在應(yīng)用過(guò)程中可以極好地相互補(bǔ)充.由于SIET
技術(shù)的出現(xiàn)，人們對(duì)于生物體特異離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究，在靈敏度上，時(shí)間和空間分辨率上已經(jīng)被大大地提高了，并已成熟地與細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)、其他電生理技術(shù)和顯微熒光成像技術(shù)配合使用.SIET
技術(shù)將在主動(dòng)運(yùn)輸離子或分子泵和協(xié)同運(yùn)輸載體的研究方面發(fā)揮重大的作用.

分子生物學(xué)的進(jìn)展使得我們能夠?qū)�質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體分子加以確定、克隆和進(jìn)行可控制的表達(dá).當(dāng)這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體在分子水平方面通過(guò)在酵母、卵細(xì)胞等系統(tǒng)中的表達(dá)予以鑒定，或者某些細(xì)胞成份的物理結(jié)構(gòu)和生理功能闡明之后，SIET
技術(shù)的非損傷性，多離子/分子同時(shí)測(cè)量及靈活的空間測(cè)量方式將在細(xì)胞和組織水平上的功能鑒定方面發(fā)揮重要的、甚至是無(wú)法替代的作用.

　

致謝

感謝匡廷云院士在身患重病的情況下對(duì)SIET
技術(shù)的關(guān)心與支持.同時(shí)感謝美國(guó)Duke大學(xué)裴真明教授所作的有益的討論. 

 

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