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電生理基本技術

瀏覽次數(shù):2855 發(fā)布日期:2008-4-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
一.電刺激。
二.生物放大器:正確選擇,植物性神經(jīng)沖動幅度多為50-100μV。不同組織,應采用不同的參 數(shù)。如
ECG:振幅0.1-2mV, 靈敏度0.5-1mV,時間常數(shù)0.1-1.0s,高頻濾波1KHz植物性神經(jīng)沖動:振幅50-150μV, 靈敏度25-100μV,時間常數(shù)0.01-0.1s,高頻濾波3-5KHz
中樞神經(jīng)元單位放電:振幅100-300μV,靈敏度50-100μV,時間常數(shù)0.01-0.1s,高頻濾波5-10KHz

三.玻璃微電極:
常用尖端0.5-5μm,向細胞內(nèi)插入時,需小于0.5μm(細胞直徑的1/10~1/100),且尖端的傾斜度應相當緩和,一般微電極可分為金屬微電極和玻璃微電極兩類。
金屬微電極,現(xiàn)多用鍍鉑鎢絲電極(platinum-plated tungsten electrode),在鎢絲上鍍鉑,可極大改善電極的電學特性,噪聲可大大降低,加之機械強度大,適合長期體外記錄(paréD, Gaudreau H. Projection cells and interneurons of thelateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats. J Neursci, 1996,16(10):3334-3350
現(xiàn)要也常用鍍銀碳纖維電極。玻璃微電極記錄易受機械位移的影響,加之尖端的電解質(zhì)會漏出或堵塞,不適合半小時以上的長時間記錄,玻璃微電極可分單管和多管微電極。
毛坯管在國外多用Pyrex管,國內(nèi)多用GG-17和95料玻管。細胞外記錄多采用外徑1.5-2mm玻璃,細胞內(nèi)記錄則采用外徑1mm細玻管,內(nèi)外徑之比約為2:3或5:6,長6-8cm。拉制前必須經(jīng)過清潔處理。
清潔液:用等量的(250ml)王水(可反復應用)。一般毛坯管捆成把放入清潔液中1-2h,取出自來水沖洗20-30min,再放入無水酒精中洗滌,再放入盛滿蒸餾水燒杯中加熱煮沸10min,倒去蒸餾水,再換新蒸餾水反復3次,再放入烤箱中烤干,備用,切不可用市售的洗滌劑,以防降低電極充灌液的表面張力而影響沖灌。
充灌液常用3mol/L KCl,為避免Cl-擴散,也可用2mol/L醋酸鉀或檸檬酸鉀充灌,也有人用0.5-1mol/L
NaCl(低濃度)充灌可降低噪音。細胞外記錄時,最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁胺天藍溶液定位。在膜片鉗中還常加鈣螯合劑,如EGTA。阻抗與不同組織相關。

四.電生理實驗中噪聲和干擾的形成和排除。
(一)來源。
1.干擾信號與生物電生理信號的鑒別。準確區(qū)分生物電信號與干擾的偽跡是電生理實驗的先決條件。
2.來源。主要有三個方面:
其一。物理性干擾。1)靜電和電磁的干擾:實驗室附近高壓電,室內(nèi)日光燈可產(chǎn)生50Hz的靜電干擾,尤其是交流電,尤其是50Hz頻率干擾最大(電子設備為50Hz)。其特點是幅度大,波形規(guī)則。2)噪聲干擾:電子元件本身產(chǎn)生雜亂無章電壓和電流稱噪聲,一般與放大器內(nèi)部元件的質(zhì)量與性能有關。
其二。接地不良。1)地線電阻應小。2)儀器故障。產(chǎn)生漏電電流,在地線上形成電位差,產(chǎn)生干擾。3)地線行走過程中打圈,形成線圈,易接受電場和磁場的干擾。4)各儀器設備應采用一點接地的方式,若采用多點接地,形成大地回路,也會引起干擾。5)地線過長與電源線形成交流環(huán)路。6)誤用市電三孔中性線作為大地線(中性線上有4-5A電流)。
其三。生理性干擾。1)大腦電活動時,眨眼、眼球運動均對腦電具有干擾作用。2)實驗中環(huán)境溫度過低,動物寒戰(zhàn)、抖動,引起肌電的發(fā)放而干擾記錄,或因呼吸運動引起記錄部位機械位移引起干擾信號。3)心電干擾,頻率與心電一致。
(二)排除。
1.物理性干擾。1)屏蔽法:用于低頻電和靜電干擾,屏蔽線分布電容較大,線與線之間不可平行排列,更不可為了美觀而將多線扎在一起,這會加大分布電容,易偶合高頻干擾噪聲。2)遠離法。3)改變位置法。依電流方向相反,產(chǎn)生反向磁場的原理,改變各個儀器的位置或放大器輸入的方位,會使干擾磁場抵消,微電極放大器探頭阻抗高,易引入干擾,實驗前可反復調(diào)整其方向和位置。4)微電極記錄時盡量減少微電極本身的阻抗,減少輸入阻抗及干擾信號在這個阻抗上形成干擾電壓降,微電極到探頭的連線<5cm。5)用監(jiān)聽器監(jiān)聽噪聲,以便及時排除。
2.儀器質(zhì)量,盡量改進。
3.接地不良。地線應盡量短粗,不能與電源線平行或打圈,不 要接在電源線的中性線
上,地線單獨埋設,埋置處應較潮濕,附近無大型變壓電動機,并在坑內(nèi)加些食鹽。
4.檢查各儀器 是否漏電。
5.慢生物電變化時用乏極化電極,實驗對象宜安靜,勿受振動。
(三)刺激偽跡過大及防止。1)盡量減少刺激脈沖的波寬和強度。2)在動物體或標本上,盡量延長刺激部位的距離,在刺激電極和引導電極之間加一接地電極,此電極離引導電極愈近,刺激偽跡就越;采用變換刺激極性,結合疊加處理,可抵消偽跡。
注:微電極中高濃度充灌液易蒸發(fā),造成電極回路的開路,因此常在微電極插入Ag-AgCl絲或鉑金絲后,在微電極尾部開口處涂上一層凡士林,防止水分蒸發(fā)。
動物麻醉和制動下,體溫會下降,故應保溫調(diào)節(jié),加溫維持肛溫36-38℃.
記錄脊髓背角或腹角神經(jīng)元將脊柱前后拉直以減小呼吸運動造成的位移。記錄腦神經(jīng)元應在表面用溫熱石蠟制成一油槽,防止血管博動和呼吸運動的影響。

五.細胞內(nèi)微電極記錄
多用幼年離體標本,其原因:1)幼年動物骨骼骨化不完全,結締組織少,神經(jīng)組織易于分離,標本耐缺氧能力強,有的標本可存活數(shù)小時至數(shù)天,但標本也可能發(fā)育不完全,如背根和腦干到脊髓的投射纖維要到三周動物才完全。神經(jīng)纖維髓鞘化不全,其藥理作用與成年動物也不同。從實驗角度上講,脊髓背腹根短,不利于電生理刺激記錄。小鼠一般應小于15g,制備標本才
有可能成功,而這樣小鼠背腹根神經(jīng)節(jié)不利于電生理實驗。最適合的動物是金黃地鼠(hamster),介于大小鼠之間,制備標本活性很好,可能與其冬眠習性有關,而且其脊髓背腹根長達20-25mm,利于電生理記錄。動物選擇仍依實驗而定,同一標本,不同中樞結構對缺氧耐受力也不同。金黃地鼠,若觀察脊髓背角神經(jīng)元活動,可用150-160g體重的鼠均可,但要研究腹角神經(jīng)元,則體重不宜超過30g。離體標本的灌流注,如ACSF。其中緩沖液成分有兩種,一是重碳酸鹽(bicarbonate):溫度低(4℃),配方有利于降低組織興奮性。二是磷酸鹽緩沖液和HEPES緩沖液:其優(yōu)點是接近于人體環(huán)境。各種緩沖液一般都先配母液,臨用前一天,或臨用前稀釋。

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