一、 前言[1，2]
基因工程已令人難以置信的擴展了我們關于有機體DNA序列的認識。但是仍有許多新識別的基因的功能還不知道，也不知道基因產(chǎn)物是如何相互作用從而產(chǎn)生活的有機體的。功能基因組試圖通過大規(guī)模實驗方法來回答這些問題。但由于僅從DNA序列尚不能回答某基因的表達時間、表達量、蛋白質翻譯后加工和修飾的情況、以及它們的亞細胞分布等等，因此在整體水平上研究蛋白質表達及其功能變得日益顯得重要。這些在基因組中不能解決的問題可望在蛋白質組研究中找到答案。蛋白質組研究的數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)的整合，將會在后基因組研究中發(fā)揮重要作用。
目前蛋白質組研究采用的主要技術是雙向凝膠電泳和質譜方法。雙向凝膠電泳的基本原理是蛋白質首先根據(jù)其等電點，第一向在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦，然后轉90度按他們的分子量大小進行第二向的SDS-PAGE分離。質譜在90年代得到了長足的發(fā)展，生物質譜當上了主角，蛋白質組學又為生物質譜提供了一個大舞臺。他們中首選的是MALDI-TOF，其分析容量大，單電荷為主的測定分子量高達30萬，干擾因素少，適合蛋白質組的大規(guī)模分析。其次ESI為主的LC-MS聯(lián)機適于精細的研究。本文將簡介幾種常用的生物質譜技術，并著重介紹生物質譜技術在蛋白質組學各領域的應用。

二、 生物質譜技術[3，4]
1．電噴霧質譜技術（ESI）[5]
電噴霧質譜技術( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS)
是在毛細管的出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面的電荷強度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子,
使質量電荷比(m/ z) 降低到多數(shù)質量分析儀器都可以檢測的范圍,因而大大擴展了分子量的分析范圍,離子的真實分子質量也可以根據(jù)質荷比及電荷數(shù)算出。

2．基質輔助激光解吸附質譜技術（MOLDI）[5-7]
基質輔助激光解析電離（MOLDI）是由德國科學家Karas和Hillenkamp發(fā)現(xiàn)的。將微量蛋白質與過量的小分子基體的混合液體點到樣品靶上，經(jīng)加熱或風吹烘干形成共結晶，放入離子源內(nèi)。當激光照射到靶點上時，基體吸收了激光的能力躍遷到激發(fā)態(tài)，導致蛋白質電離和汽化，電離的結果通常是基體的質子轉移到蛋白質上。然后由高電壓將電離的蛋白質從離子源轉送到質量分析器內(nèi)，再經(jīng)離子檢測器和數(shù)據(jù)處理得到質譜圖。TOF質量分析器被認為是與MALDI的最佳搭配，因為二者都是脈沖工作方式，在質量分析過程中離子損失很少，可以獲得很高的靈敏度。TOF質量分析器結果簡單，容易換算，蛋白質離子在飛行管內(nèi)的飛行速度僅與他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通過計算蛋白質離子在飛行管內(nèi)的飛行時間推算出蛋白質離子的m/z值。與傳統(tǒng)質量分析器相比，更易得到高分辨率和高測量精度；速度快，離子飛行時間僅為幾個μs和約100μs之間；質量范圍寬，可以直接檢測到幾十萬道爾頓的單電荷離子。飛行時間質量分析器被認為是21世紀最有應用前景的質量分析器。

3．傅立葉變換－離子回旋共振質譜（FT-ICR MS）[8，9]
傅立葉變換-離子回旋共振質譜法(FT-ICR
MS)是離子回旋共振波譜法與現(xiàn)代計算機技術相結合的產(chǎn)物。傅立葉變換-離子回旋共振質譜法是基于離子在均勻磁場中的回旋運動,
離子的回旋頻率、半徑、速度和能量是離子質量和離子電荷及磁場強度的函數(shù), 當對離子施加與其回旋頻率相同的射頻場作用時, 離子將同相位加速到一較大的半徑回旋,
從而產(chǎn)生可被接受的類似電流的信號。傅立葉變換-離子回旋共振質譜法所采用的射頻范圍覆蓋了欲測定的質量范圍,所有離子同時被激發(fā), 所檢測的信號經(jīng)過傅立葉變換,
轉換為質譜圖。其主要優(yōu)點有：容易獲得高分辨；便于實現(xiàn)串極質譜分析；便于使用外電離源并與色譜儀器聯(lián)用。此外，他還有靈敏度高，質量范圍寬，速度快，性能可靠等優(yōu)點。

4．快原子轟擊質譜技術（FABMS）
快原子轟擊質譜技術( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS)
是一種軟電離技術,是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品,使樣品離子濺出進入分析器,這種軟電離技術適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析,特別適用于多肽和蛋白質等的分析研究。FABMS能提供有關離子的精確質量,從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMS
-MS 串聯(lián)技術的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息,從而使其在生物醫(yī)學分析中迅速發(fā)展起來。
三、蛋白質的分析鑒定[3, 4, 10]
隨著質譜技術的發(fā)展，分子量的測定已從傳統(tǒng)的有機小分子擴展到了生物大分子。MALDI-MS技術以其極高的靈敏度、精確度在蛋白質分析中得到了廣泛的應用。該技術不僅可測定各種疏水性、親水性和糖蛋白的分子量，還可直接測定蛋白質混合物的分子量。這可認為是蛋白質分析領域的一項重大突破。
蛋白質組的研究是從整體水平上研究細胞或有機體內(nèi)蛋白質的組成及其活動規(guī)律。質譜技術作為蛋白質組研究的三大支撐技術之一，除了用于多肽，蛋白質的分子量測定外，還廣泛的應用于肽指紋圖譜測定及氨基酸序列測定。
肽指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting,
PMF)測定是對蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進行質譜分析的方法。質譜分析所得肽斷與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質的理論肽斷進行比較，判斷出所測蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質具有不同的氨基酸序列，不同蛋白質所得肽斷具有指紋特征。采用肽指紋譜的方法已對酵母、大腸桿菌、人心肌等多種蛋白質組進行了研究。
對肽序列的測定往往要應用串連質譜技術，采用不同的技術選擇特定質核比的離子，并對其進行碰撞誘導解離，通過分析肽段的斷裂情況推導出肽序列。

四、后轉錄修飾的蛋白質的檢測和識別
在蛋白質組的研究中，蛋白質和多肽的序列分析已不局限于闡明蛋白質的一級結構，對翻譯后的修飾的進一步分析也是蛋白質化學的一項重要任務。這種修飾對于蛋白質的功能非常重要，如：細胞識別中的蛋白質相互作用，信號傳導和蛋白質定位。
1． 蛋白質的糖基化[11, 12]
糖蛋白在細胞內(nèi)部，細胞膜和細胞外均有發(fā)現(xiàn)，實際上大部分蛋白質是糖蛋白。對糖蛋白的檢測和分析發(fā)現(xiàn)，糖蛋白中糖組分的結構和功能具有多樣性。糖蛋白中的糖通常是不同種類的，而且是由一些可控數(shù)量的單糖組成。糖基化的多樣性與細胞周期，細胞分化和發(fā)展的狀態(tài)有關。在蛋白組時代中，蛋白質的修飾會引起其理化性質的改變，因此是不容忽視的。
從1D或2D凝膠得到的糖基化蛋白的識別，一般是進行MALDI-MS指紋分析，
或是對MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片譜進行分析。對完整的糖蛋白的研究是非常困難的，所有已知的離子化技術都有其局限性。目前，人們主要研究糖肽，其好處之一就是質量減小了，這就會得到更好的分辨率，而且糖肽仍保留了糖基化位點。將分離的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可進行糖肽的研究。一旦糖肽被識別出，就可以用串連質譜(ESI-MS/MS)來闡明肽序列。當?shù)鞍椎男蛄幸阎獣r，計算質量差就可推出其上附著的寡糖的質量。
要將糖部分從糖蛋白中釋放出來，可用化學切割或酶切割（流程圖見圖1）。目前，連有結構專一性糖苷酶的質譜在提供序列，分支和鏈接數(shù)據(jù)方面是最有力的技術。對于N糖基化常用的糖苷內(nèi)切酶有PNGase-F,
PNGase-A,
EndoF和EndoH�；瘜W切割也可以用來釋放O-連接和N-連接的多糖，但經(jīng)常出現(xiàn)的缺點是他會完全破壞所有的肽鍵，因而丟失了關于糖附著位點的信息。而且這些切割不能從糖肽中連續(xù)釋放單糖。用肼的化學切割可以除去兩種類型的糖基化。在60℃可專一性的釋放O-連接的糖，而在95℃能釋放N-連接的糖。釋放O-原子更常用的方法是用堿進行β消除。通常，糖基中加入金屬離子在MALDI和ESI中離子化。用MALDI-MS分析糖類的一個好的選擇是將之與其他一些化合物混合，這樣可以進一步提高靈敏度和分辨率。不同的質譜方法可以產(chǎn)生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導解離
(CID)譜，這可以給出有關糖的序列，分支及糖間的連接等信息。

2． 蛋白質的磷酸化[13, 14]
蛋白質中氨基酸的磷酸化在生命系統(tǒng)中起重要的作用。磷酸化經(jīng)常作為分子開關控制不同過程蛋白質的活性，如新陳代謝，信號傳導，細胞分裂等過程。因此，蛋白質中磷酰氨基酸的識別在蛋白質分析中是一項重要的工作。已知的磷酰氨基酸的類型有四種：
1．O-磷酸鹽，通過羥氨酸的磷酸化形成的，如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。
2．N-磷酸鹽，通過精氨酸，賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。
3．乙酰磷酸鹽，通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。
4．S-磷酸酯，通過半胱氨酸的磷酸化形成的。
用質譜分析磷酸化時主要存在的問題是，混合物中磷酸化肽的信號被抑制。因此只有當一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后,
分析磷酸化的肽才會變得容易些。一些相應的用于質譜分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白質的分離和富集方法和技術已有所發(fā)展，現(xiàn)已建立的分離技術有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)，高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對于32P標記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲屏檢測，提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析；如果32P標記不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC與質譜聯(lián)用。
 
常用的富集方法有：固定金屬親和色譜(IMAC)，IMAC是選擇性分離和富集磷酸化肽最廣泛的方法。此方法中,
鍵合在螯合底物上的金屬離子(通常是Fe3+或Ga3+)選擇性地與磷酸化肽中的磷酸部分相結合, 并且在高pH
或磷酸緩沖液中磷酸化肽可以釋放出來�？贵w免疫沉淀，高親和性抗體可以從復雜混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗體富集蛋白/肽僅局限于分析磷酸化酪氨酸,
然后用MALDI－TOF MS分析與抗體相聯(lián)接的磷酸化肽。盡管用于免疫沉淀的抗體對其底物必須有相對高的親和力,
但低親和力抗體仍然可以有效地用于免疫印跡Western-blotting分析�；瘜W修飾，已建立了兩種從復雜混合物中專一分離磷酸化蛋白/肽的方法[15,16]。但兩種方法都有待進一步優(yōu)化以鑒定低豐度蛋白質。
磷酸化肽的檢測和磷酸化位點的確定主要有以下MS技術：MALDI-TOF MS
可以通過肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質，與磷酸酯酶處理相結合可以確定磷酸化位點。其原理是磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團而產(chǎn)生特定質量數(shù)的變化，MALDI-TOF
MS通過檢測這種質量數(shù)的變化而確定磷酸化位點。串聯(lián)質譜(MS/MS)
可進行前體離子掃描，這一方法是通過檢測磷酸基團產(chǎn)生的特定片段來報告磷酸肽的存在。磷酸化肽經(jīng)CID后會產(chǎn)生磷酸基團的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質譜進行前體離子掃描時可作為磷酸肽的“報告離子”。串聯(lián)質譜還可進行中性丟失掃描，這種方法是用MS/MS檢測經(jīng)CID后發(fā)生中性丟失H3PO4
(98 u)的肽段。另外，由于液相色譜分離肽降低了離子抑制效應，也有人用LC-MS/MS分析磷酸化位點。傅立葉變換質譜進行電子捕獲解離
電子捕獲解離(ECD)與傅立葉變換離子回旋加速共振(FTICR)質譜相連是蛋白質、肽測序和研究蛋白質翻譯后修飾的一個有力方法。近來，它已被成功地用于鑒定肽片段上發(fā)生磷酸化的殘基。

五、 小結
目前,生物質譜被認為是大規(guī)模、高通量進行蛋白結構鑒定的首選工具,但與之結合的2-D電泳仍有缺點,如工作量大,重現(xiàn)性差。因此,將對其進行改進,如分子掃描技術等。由于通過LC-MS/MS可直接鑒定蛋白混合物,因此將來有望不通過2-D
就能研究蛋白質組。當然,這還需要解決一些技術問題,其中最根本的是質譜的定量問題。生物質譜的魅力在于它能幫助我們研究蛋白-
蛋白間相互作用、翻譯后修飾乃至基因表達水平的變化等。相信,隨著生物質譜技術和數(shù)據(jù)采集軟件技術的不斷飛速發(fā)展,我們將能夠獲得這方面的更多信息,從而揭示出生命活的奧秘。
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