當(dāng)國內(nèi)抗擊新型冠狀病毒已經(jīng)取得階段性勝利，各地方政府推出各種積極鼓勵政策，普及全民免費接種新冠病毒疫苗的時候，當(dāng)?shù)貢r間2021年5月3日，剛果（金）衛(wèi)生部宣布，該國第12輪埃博拉疫情結(jié)束......
 

“國民男神”張文宏醫(yī)生曾與樊登對話時指出：“如果今年新冠的死亡率、病死率，是像埃博拉一樣的，其實這個病還是比較容易控制的。”
 

埃博拉病毒，一個既熟悉又陌生的名字。
 

埃博拉病毒（EBOV）是一種膜包被的負(fù)單鏈RNA病毒，屬于Filoviridae家族，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白。該病毒在人類和非人類靈長類動物中可引起嚴(yán)重的出血性發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、肌痛、肝腎功能損傷等臨床癥狀。迄今為止，已確定6種埃博拉病毒，包括扎伊爾型埃博拉病毒（ZEBOV），該病毒對人類的致死率最高，死亡率為60％ ~ 90％。2014年至2016年，西非國家利比亞、幾內(nèi)亞和塞拉利昂曾爆發(fā)了最大規(guī)模的埃博拉病毒，導(dǎo)致超過28000人感染，11000人死亡。這次爆發(fā)主要是由扎伊爾型埃博拉病毒所引起，世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布進(jìn)入國際關(guān)注的公共衛(wèi)生緊急狀態(tài)。2021年2月至5月，剛果（金）民主共和國北基伍省共發(fā)現(xiàn)確診病例12例，其中死亡6例。埃博拉疫情能被一次又一次得到有效控制，死亡率降低，感染人數(shù)減少，不得不說，很大一部分原因是得益于埃博拉疫苗的普及。
全球第一個上市預(yù)防埃博拉病毒病的商品化疫苗ERVEBO®，即rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗，2019年已獲得歐盟EMEA和美國FDA批準(zhǔn)使用。此疫苗由Merck公司研發(fā)生產(chǎn)，采用多種創(chuàng)新性的技術(shù)。其疫苗分析研究進(jìn)展與疫苗工藝開發(fā)和商業(yè)化部門于2020年8月發(fā)表題為Characterization of rVSV∆G-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting的文章， 披露了利用全自動毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺表征rVSV∆G-ZEBOV-GP糖蛋白的詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)。

研究背景

EBOV主要通過由病毒糖蛋白（GP）介導(dǎo)的相互作用來感染宿主細(xì)胞。EBOV基因組由于轉(zhuǎn)錄停頓可產(chǎn)生三種不同的包膜GP變體。未編輯的RNA轉(zhuǎn)錄編碼一個非結(jié)構(gòu)分泌型GP（sGP）蛋白。開放閱讀框（ORF）的+1轉(zhuǎn)變，可產(chǎn)生一個結(jié)構(gòu)上重要的病毒膜結(jié)合型GP蛋白。最后，ORF的+2轉(zhuǎn)變，可產(chǎn)生一個非結(jié)構(gòu)小型分泌型GP（ssGP）。每種蛋白在致病機制方面的作用先前已經(jīng)描述。EBOV GP合成為一個多肽，被一種類似呋喃的蛋白酶裂解，生成一個異質(zhì)二聚體，由GP1和GP2亞基組成，通過一個二硫鍵連接在一起。ZEBOV包膜GP蛋白的表面含有17個N-連接糖和許多糖基化位點。GP1負(fù)責(zé)與細(xì)胞受體的結(jié)合，有三個結(jié)構(gòu)域，包括一個受體結(jié)合域、一個糖帽和一個非結(jié)構(gòu)性的重度O型糖基化區(qū)域（粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域）。GP2有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與病毒的融合。GP2∆，發(fā)現(xiàn)于脫落GP蛋白，是TNF-a轉(zhuǎn)換酶（TACE）對GP2進(jìn)行酶切的結(jié)果。EBOV的細(xì)胞進(jìn)入機制，是由組織蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的，它裂解完整的EBOV GP1，去除糖帽和粘液蛋白結(jié)構(gòu)域，暴露出增加受體結(jié)合和病毒感染性的氨基酸殘基。
 

該項研究闡述了在整個rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗生產(chǎn)過程中，使用全自動定量毛細(xì)管Western Blot檢測平臺，研究和表征ZEBOV糖蛋白。自動化Western Blot與傳統(tǒng)手工Western Blot技術(shù)平臺相比有諸多優(yōu)點：
 

1. 線性范圍增加

2. 更高的通量

3. 因自動化而增強的重復(fù)性
    

由于該技術(shù)的高特異性，毛細(xì)管Western Blot技術(shù)已被應(yīng)用于疫苗產(chǎn)品和治療性蛋白質(zhì)的表征。該項目中，研究人員還進(jìn)行了方法學(xué)對比，對比了傳統(tǒng)手動Western Blot技術(shù)與全自動毛細(xì)管Western Blot檢測技術(shù)。

研究結(jié)論


我們已開發(fā)和應(yīng)用基于全自動毛細(xì)管Western Blot檢測方法，去開發(fā)及生產(chǎn)ERVEBO®疫苗。使用該方法表征在疫苗生產(chǎn)的過程中，GP變體的類型和數(shù)量。毛細(xì)管Western Blot技術(shù)提供了與傳統(tǒng)手動Western Blot系統(tǒng)相似的GP結(jié)果。但是，具有更好的重復(fù)性，更準(zhǔn)確的定量，并更簡單易用。該方法有助于表征疫苗生產(chǎn)中酶促反應(yīng)步驟，評估下游純化步驟中的變化，并確認(rèn)多批次間的工藝穩(wěn)定性。實驗表明，使用VSV載體產(chǎn)生的GP、sGP和ssGP的相對數(shù)量與天然埃博拉病毒中觀察到的不同。GP蛋白是在感染期間產(chǎn)生的，只有病毒粒子膜結(jié)合的GP包含在rVSVΔG-ZEBOV-GP疫苗最后的DP中。毛細(xì)管Westerns表明，ERVEBO®生產(chǎn)過程中的每個步驟都有獨特的電泳圖，該方法可以作為一個有利的工具，去評估生產(chǎn)過程的不同階段。

方法學(xué)對比


根據(jù)工序，rVSV∆G-ZEBOV-GP使用1x樣品緩沖液中稀釋至7倍。初步稀釋后，將樣品在2個混合物（含樣品緩沖液、二硫蘇糖醇和熒光標(biāo)準(zhǔn)品）中稀釋2倍，在70℃下加熱10分鐘。隨后，樣品經(jīng)短暫渦旋去除氣泡后，加載到12-230 kDa的樣品板上。一抗（兔抗ZEBOV-GP）母液被加載到樣品板前，用抗體稀釋液（終濃度為2μg/mL）稀釋1000倍。毛細(xì)管Western Blot儀器采購于ProteinSimple公司（Santa Clara, CA, USA）。儀器設(shè)置定義如下：分離時間設(shè)置為30分鐘，一抗體孵育時間為30至60分鐘，二抗體孵育時間為30至60分鐘。使用儀器的化學(xué)發(fā)光檢測通道在不同的曝光長度下進(jìn)行檢測。除非另有規(guī)定，曝光時間為2s。所有未指定的設(shè)置均采用供應(yīng)商的默認(rèn)選項。

Merck早在2012年就曾發(fā)表文章指出，對比傳統(tǒng)手動WB （羅氏于2005年發(fā)表：CV > 35%），ProteinSimple全自動Western Blot檢測平臺的數(shù)據(jù)CV值可以控制在10%以內(nèi)。

結(jié)果展示

(A) 收獲病毒液（HVF：Harvested virus fluid）為工藝流程中最早的步驟，即病毒轉(zhuǎn)染后收獲。包含：GP1（260 kDa）、未知（190 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa）；
 

(B) 澄清病毒液（CVH：Clarified viral harvest）為工藝流程中的第二步，過死端過濾以去除細(xì)胞碎片和樣品。包含：GP1（260 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa），未知的190 kDa峰被去除；
 

(C) 反應(yīng)后病毒收獲（RVH：Reacted viral harvest ），在純化過程的酶解步驟之后。包含：由胰蛋白酶處理的GP1、可溶性GP（95 kDa）、GP2 + GP2∆（40 kDa）和較低分子量的蛋白質(zhì)（<12 kDa）組成，可能是胰蛋白酶處理后產(chǎn)生的GP1片段；
 

(D) 超濾產(chǎn)品（UFP：Ultrafiltration product），樣品被超濾后。包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），所有可溶性GP和脫落的GP被去除；
 

(E) 藥物產(chǎn)品（DP: Drug product），通過加入Tris和rHSA （recombinant Human Serum Albumin:重組人血清白蛋白）稀釋DS（Drug substance：原藥）至目標(biāo)濃度。
 

包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），由于rHSA與一抗的交叉反應(yīng)，DP中觀察到一個約60 kDa的rHSA峰，DP濃度比UFP中低約2-logs。原藥電泳圖（補充信息圖.1S）與UFP相似，因為其濃度與UFP相似，盡管含有rHSA作為穩(wěn)定劑。
 

圖片中的峰高經(jīng)過調(diào)整，以最好地呈現(xiàn)出每個樣品。

A) 胰蛋白酶處理CVH樣品時間過程電泳圖，GP1峰在10分鐘內(nèi)從260 kDa轉(zhuǎn)移到95 kDa，隨著時間的推移，峰面積持續(xù)減少；

(B) 加入胰蛋白酶抑制劑后結(jié)果，RVH樣品在室溫下進(jìn)行Hold Time Study。在168小時內(nèi)，GP1峰值持續(xù)緩慢下降。

(A) 四個不同批次的CVH中GP和可溶性GP的峰面積百分比；

(B) 其中一個批次的CVH的電泳圖，顯示峰值積分和分配；

(C) 四個不同批次的UFP樣品，顯示峰面積分布；

(D) UFP樣品的電泳圖，顯示峰值積分整合和分配。四個批次CVH樣品中，GP（包括GP1和GP2+GP2Δ）占總峰面積的78%，可溶性GP平均占22%。
 

全自動毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺展望
 

后疫情時代，我們依然需要居安思危，對科學(xué)與自然保持敬畏之心。潛心開發(fā)傳統(tǒng)疫苗、亞單位疫苗、聯(lián)合疫苗、核酸疫苗和治療性疫苗，惠及人民。作為地球人，疾病無國界，先進(jìn)技術(shù)無國界，愛與幫助也同樣無國界。國外成熟的疫苗研發(fā)與生產(chǎn)技術(shù)路線，值得我們學(xué)習(xí)和借鑒。
 

ProteinSimple全自動毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺，已被眾多科研工作者使用，從事人用和獸用疫苗相關(guān)研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控，包括埃博拉病毒疫苗，狂犬病病毒疫苗，肺結(jié)核病病毒疫苗，新型人乳頭瘤病毒疫苗，SARS-CoV-2疫苗等等。正如ERVEBO®生產(chǎn)整個過程中，全自動毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺可呈現(xiàn)出獨特的電泳圖，去評估疫苗生產(chǎn)過程的不同階段。其高質(zhì)量高重復(fù)性數(shù)據(jù)（CV < 10%）、全自動高通量快速檢測流程（25個樣品僅需3h，最高通量為96個樣品）、超微量樣品（僅需3ul）、除分子量分離外，可兼容等電點分離的靈活應(yīng)用，等等諸多優(yōu)勢，使得全自動毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺逐漸取代傳統(tǒng)手工Western Blot檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：
1. Characterization of rVSVΔG-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting, K. Minsker, R. Rustandi, S. Ha and J. Loughney, Vaccine, 2020; 38(45):7166–7174.

2. Qualitative and quantitative evaluation of SimonTM, a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development, R. Rustandi, J. Loughney, M. Hamm, C. Hamm, C. Lancaster, A. Mach and S. Ha, Electrophoresis, 2012; 33:2790–2797.

3. Precision and variance components in quantitative gel electrophoresis, Koller, A. and H. Watzig, Electrophoresis, 2005; 26(12):2470-2475.

代表文獻(xiàn)：

1. A single-dose live-attenuated YF17D-vectored SARS-CoV-2 vaccine candidate, L. Sanchez-Felipe, T. Vercruysse, S. Sharma, J. Ma, V. Lemmens, D. Van Looveren, M. Javarappa, R. Boudewijns, B. Malengier-Devlies, L. Liesenborghs, S. Kaptein, C. De Keyzer, L. Bervoets, S. Debaveye, M. Rasulova, et al., Nature, 2021; 590: 320–325.

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4. Inactivated rabies virus-vectored immunocontraceptive vaccine in a thermo-responsive hydrogel induces high and persistent antibodies against rabies, but insufficient antibodies against gonadotropin-releasing hormone for contraception, X. Wu, Y. Yang, C. Kling, L. Seigler, N. Gallardo-Romero, B. Martin, T. Smith and V. Olson, Vaccines, 2019; 7: 73.

5. Quantitation of CRM197 using imaged capillary isoelectric focusing with fluorescence detection and capillary Western, J. Loughney, S. Ha and R. Rustandi, Analytical Biochemistry, 2017; 534:19–23.

6. Neutralization of diverse human cytomegalovirus strains conferred by antibodies targeting viral gH/gL/pUL128-131 pentameric complex, S. Ha, F. Li, M. Troutman, D. Freed, A. Tang, J. Loughney, D. Wang, I. Wang, J. Vlasak, D. Nickle, R. Rustandi, M. Hamm, P. DePhillips, N. Zhang, J. McLellan, et al., Journal of Virology, 2017; 91:e02033-16.

7. Applications of an automated and quantitative CE-based size and charge western blot for therapeutic proteins and vaccines, R. Rustandi, M. Hamm, C. Lancaster and J. Loughney, Methods in Molecular Biology, 2016; 1466:197–217.