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QIAcuity數(shù)字PCR攜手LNA技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因突變精準(zhǔn)檢測(cè)

瀏覽次數(shù)：9750　發(fā)布日期：2021-2-4　來(lái)源：凱杰生命科學(xué)

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前約有10000多種人類(lèi)疾病是由基因突變引起的^[1]，其中癌癥是對(duì)人類(lèi)威脅最為嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu) (IARC) 發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，過(guò)去一年全球癌癥新發(fā)1929萬(wàn)例，其中中國(guó)占23.7%；全球癌癥死亡的30.1%也發(fā)生在中國(guó)。預(yù)防癌癥發(fā)生的最有效的辦法就是早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療。而基因突變作為引發(fā)癌癥發(fā)生的最重要因素之一，究其原因主要是基因突變誘導(dǎo)原癌基因的激活和抑癌基因的失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度增殖和免于細(xì)胞的凋亡^[2]。

稀有突變檢測(cè)是指在野生型背景池中僅檢測(cè)到1%甚至更低的突變體。所以，對(duì)于單堿基等稀有突變或單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)和量化，數(shù)字PCR憑借特有的樣品微反應(yīng)單元分區(qū)技術(shù)，可以增加樣品的有效反應(yīng)濃度，減少背景信號(hào)干擾，降低PCR抑制劑對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響，從而實(shí)現(xiàn)特定核酸序列的更精準(zhǔn)和更靈敏的檢測(cè)^[3]。

QIAGEN 2020年下半年重磅推出的QIAcuity一體化集成式納米微孔板數(shù)字PCR系統(tǒng)將微反應(yīng)單元制備、PCR擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取集成到一臺(tái)全自動(dòng)儀器中，整個(gè)流程最快2小時(shí)內(nèi)完成。QIAcuity采用專(zhuān)利納米微孔板利用微流體技術(shù)對(duì)微反應(yīng)單元做物理分割，使分配到每個(gè)納米小孔中的反應(yīng)液體積均一，無(wú)反應(yīng)體系破裂融合或交叉污染，搭配特異性更高的QIAGEN LNA Mutation Assay，QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)為科學(xué)家們?cè)谙∮型蛔儥z測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了一個(gè)更好的選擇。

QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)

QIAGEN在QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)上開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了針對(duì)常見(jiàn)突變位點(diǎn)檢測(cè)的250組dPCR LNA Mutation Assay，該Assay的引物和探針都經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾來(lái)提高特異性及檢測(cè)靈敏度。探針可選擇FAM/HEX或Atto550/ROX雙標(biāo)記不僅可實(shí)現(xiàn)野生型和突變型靶標(biāo)分子的同時(shí)檢測(cè)更可在一管反應(yīng)中進(jìn)行多個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)。所有突變位點(diǎn)均選自COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)，確保了突變位點(diǎn)研究的可靠性。

dPCR LNA Mutation Assay

可同時(shí)檢測(cè)野生型和突變型靶標(biāo)

所謂鎖核酸 (Locked Nucleic Acid，LNA) 技術(shù)，是將寡核苷酸序列中的β-D-呋喃核糖的2’-O，4’-C位通過(guò)縮水形成的剛性結(jié)構(gòu)，增加引物和探針的Tm值，從而實(shí)現(xiàn)更短的引物和探針設(shè)計(jì)。在檢測(cè)稀有突變時(shí)，由于樣本濃度低并且在突變前后整個(gè)靶標(biāo)分子的序列可能僅有單個(gè)堿基的差別，通過(guò)鎖核酸修飾的探針和引物增強(qiáng)了對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性。經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾的LNA Mutation Assay結(jié)合QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)可以在野生型基因組背景下檢測(cè)到低于0.1%的突變體，對(duì)于液體活檢中的ctDNA和cfDNA的低頻突變檢測(cè)尤為適合。

鎖核酸技術(shù)可實(shí)現(xiàn)更短序列引物或探針、更高Tm值

高靈敏度

QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)結(jié)合dPCR LNA Mutation Assay對(duì)不同梯度稀釋的腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示：檢測(cè)值與預(yù)期值一致性良好，突變頻率的檢測(cè)限達(dá)到了0.1%。

常見(jiàn)基因突變頻率預(yù)期與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果比較

高精準(zhǔn)度

QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)結(jié)合dPCR LNA Mutation Assay對(duì)已知突變頻率為0.1%的BRAF V600E基因進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示：檢測(cè)值為0.13%，相當(dāng)于每個(gè)已知突變樣本中檢測(cè)到6拷貝的突變分子，與預(yù)期值0.1%幾乎一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：數(shù)字PCR為檢測(cè)野生型背景下的突變DNA序列提供了高精準(zhǔn)度的檢測(cè)方法；使用LNA增強(qiáng)的dPCR LNA Mutation的引物和探針，提高了檢測(cè)的特異性和精準(zhǔn)度。