細胞培養(yǎng)過程中的隱形污染（支原體）是普遍的問題，面對支原體污染帶來的巨大難題，世界各國開始重視，對細胞進行了質量控制，得到了有效控制。

支原體是什么？

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細胞微生物，無細胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，細胞培養(yǎng)過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體，其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。

采用常規(guī)的顯微鏡無法直接觀察到支原體，當細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發(fā)生改變，而細胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。因此細胞都需要定期（如每個月）進行支原體污染的檢測。

如何判斷細胞是否被支原體感染？

一般根據(jù)支原體種類不同，采取不同的方法進行檢測。目前常用的檢測方法有：培養(yǎng)法、 ELISA、直接或間接的熒光染色、PCR法等，其中，前面幾種靈敏度、培養(yǎng)周期等都較長，對于普通養(yǎng)細胞的人來說不太實用。目前 PCR法靈敏度最高。且耗時較短。操作簡單、可一次做多個細胞樣本。

PCR法是20世紀80年代中期建立起來的一種體外DNA 擴增實驗，其基本原理是酶促DNA合成反應，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA聚合酶的作用，使DNA鏈擴增延伸。

支原體檢測試劑盒圖（貨號：ZQ505-K） 
 

1、Myco-PCR-Mix中加入了電泳測試時所需的色素試劑（藍色和黃色色素），PCR 反應完畢后可以直接進行凝膠電泳，反應液呈現(xiàn)鮮艷的綠色。這種預混液方案操作簡便，可最大限度地減少人為誤差，在較短時間內即可獲得檢測結果。

2、本產(chǎn)品克服了PCR 反應配置過程中的繁瑣程序，通過加入抑制非特異性結合的 cocktail，有效的整合了所有PCR反應成分，實現(xiàn)了一步法 PCR 技術新的突破。

3、引物

我司的引物序列通過參考文獻和查閱大量信息和驗證后發(fā)現(xiàn)相對市面上的引物，我司引物靈敏度更高。

通過對比不同品牌的支原體檢測試劑盒,結果發(fā)現(xiàn)陽性樣本在同一塊膠體上是有一定差異的。陽性樣本經(jīng)過3、9、27倍數(shù)稀釋后試劑盒A仍然能夠明確的檢測出來，且弱陽性條帶也相對其他試劑盒更突出。

（以下是重復3上次檢測后提供的參考圖）

樣本1為陽性樣本3倍稀釋、樣本2為陽性9倍稀釋、樣本3為陽性27倍稀釋、樣本4為弱陽性、樣本5為弱陽性、樣本6為陽性對照、樣本4為陰性對照性。Maker為1500bp

實驗樣本：

用于檢測支原體的樣品是接種后進行 3-6 天細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液。如果使用常用的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應液中。如果使用細胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進行 PCR 反應。

實驗步驟

反應體系：    Myco-PCR-Mix           24ul

                     待檢測細胞上清液          1ul

按照以上反應比例，在PCR管中將待檢測樣品上清液 1ul加入到24 Myco-PCR-Mix中，每次檢測請用Positivecontrol模版作為陽性對照，用Negative control模版作為陰性對照。

PCR反應程序為：95℃ 5min，（95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s）30 個循環(huán)，72℃ 5min， 40℃ 保存。PCR產(chǎn)物跑1.5 % 瓊脂膠，用DL2000的DNA Marker顯示片段大小。

檢測結果

待檢測樣品中如果出現(xiàn)與陽性對照大小一致（450-600 bp）的條帶，說明樣品被支原體感染。
 

如果您的細胞不幸感染了支原體，最最最好的處理方式是立即丟棄該細胞，并對培養(yǎng)箱、超凈臺等設施及場所進行消毒滅菌。因為支原體的傳播非常隱秘，相關研究表明其甚至能通過氣溶膠傳播。當然，如果您的細胞非常珍貴或者不能再獲得，可以嘗試使用抑制支原體的藥物進行處理，嘗試消除支原體污染。

這個過程一般周期較長，因為使用藥物處理時需配合多次大比例連續(xù)傳代來提高成功率。堅持，就是勝利！

支原體清除試劑盒（貨號：CSP037）
 

1、本試劑含有兩種有效的針對支原體的抗生素，抑制或清除支原體的效果通常會更強一些，其作用機制是通過干擾核糖體轉運而抑制蛋白質的合成

1、推薦使用比例為 1:200，例如 5 mL 的完全培養(yǎng)基加入 25 μ  L 支原體抑制劑混勻；

2、棄去舊的培養(yǎng)基（貼壁細胞） ，用無菌的緩沖溶液將細胞清洗干凈， 再加入含有支原體抑制劑的新鮮培養(yǎng)基；

3、根據(jù)細胞增殖情況更換含有抑制劑的培養(yǎng)基或傳代； 一般加入抑制劑后3天左右， 會出現(xiàn)明顯 的效果， 連續(xù)使用兩周后建議用支原體檢測試劑盒進行檢測。若細胞污染非常嚴重時，需延長使用時間。

4、環(huán)境、試劑耗材等可能一直存在污染源，建議需定期進行支原體檢測。
 

集贊活動

轉發(fā)本文到朋友圈，集贊滿38個，即可半價獲得中喬新舟支原體清除劑1盒（貨號：CSP037）。

1、活動日期：2024年4月1日-2024年4月30日
2、活動對象：僅限終端客戶參與活動
3、一個課題組只能參加一次
3、本活動最終解釋權歸中喬新舟所有