二代測序 (NGS) 是分子生物學(xué)實驗室的必要工具，可在多種基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究環(huán)境中用于分析核酸樣品。樣品文庫制備是 NGS 工作流程中的關(guān)鍵步驟，不僅耗時費力且成本較高。對制備過程中間步驟的起始樣品，以及對測序之前的最終文庫進行質(zhì)量控制 (QC)，可識別質(zhì)量較差或濃度不足的樣品，確保獲得成功的序列數(shù)據(jù)，有助于節(jié)省時間和資源。樣品質(zhì)量信息還可幫助排除故障或優(yōu)化文庫制備方案。
一般而言，制備 NGS 文庫所需的步驟包括起始樣品的片段化、平臺特異性測序接頭與樣品的連接以及擴增文庫以產(chǎn)生足夠的測序材料。由于最終測序結(jié)果的質(zhì)量高度依賴于文庫的質(zhì)量，因此在整個文庫制備工作流程的各個節(jié)點進行 QC 檢查有很大幫助。建議在開始文庫制備方案之前以及片段化、接頭連接、序列捕獲后或得到最終文庫之后進行 QC 檢查。QC 檢查可提供有關(guān)樣品大小、濃度和完整性的有價值的信息，高質(zhì)量樣品對于成功測序必不可少。
   通過本書，您將了解到：

• NGS 文庫制備中起始材料的質(zhì)量控制
• 整個 NGS 文庫制備過程的質(zhì)量控制
• 最終 NGS 文庫的質(zhì)量控制
• ……

  
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NGS 文庫制備中起始材料的質(zhì)量控制
文庫制備過程中最重要的 QC 步驟之一發(fā)生在 NGS 工作流程開始之前。這一關(guān)鍵 QC 步驟就是分析要使用的起始材料，無論是 DNA 還是 RNA。確保高質(zhì)量的起始材料是制備高質(zhì)量文庫并獲得成功測序結(jié)果的第一步。大多數(shù) NGS 文庫制備試劑盒建議使用特定的起始濃度和起始量，以獲得最佳測序結(jié)果。如果起始材料降解或質(zhì)量較差，可能會難以甚至無法利用樣品創(chuàng)建文庫。一些研究考察了樣品質(zhì)量和下游分析之間的相關(guān)性。
 
整個 NGS 文庫制備過程的質(zhì)量控制
確定了用于 NGS 文庫制備的合適樣品后，需采取多個步驟將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜跍y序的合適文庫。為了獲得良好可靠的測序數(shù)據(jù)，強烈建議在工作流程中多個環(huán)節(jié)設(shè)置 QC 檢查點，以確保創(chuàng)建高質(zhì)量文庫。檢查點中包括片段化和接頭連接后的樣品 QC。
  圖 2. 使用安捷倫 TapeStation 系統(tǒng)對接頭連接進行 QC。(A) 插入片段（紅色）和雙鏈接頭（藍色）的示意圖；(B) 由單鏈 DNA 組成的雙鏈接頭的電泳圖，在 75 bp 處顯示有一個峰；(C) 165 bp 為起始 DNA；(D) 使用 B 和 C 作為參照，連接后 QC 中顯示的四個峰經(jīng)鑒定為未連接接頭、未連接的插入片段，單端連接產(chǎn)物和雙端連接產(chǎn)物。PCR 后帶有雙端接頭的 165 bp 插入片段的樣品譜圖 (E) 和 (F) 示意圖。
 
最終 NGS 文庫的質(zhì)量控制
文庫制備的最后一步是 PCR 擴增，可捕獲連接接頭的片段，并生成足夠的文庫拷貝用于測序。此步驟還可以用于添加標(biāo)簽，以在單次測序運行中對多個樣品進行多重檢測。盡管最終文庫的分子量和形狀取決于所使用的文庫制備試劑盒，但使用任何一種自動化電泳平臺均可對所有類型的文庫進行可視化和分析。除文庫彌散峰以外的任何其他峰均表明存在過量的引物或接頭二聚體。此階段的分析還有助于確定文庫擴增是否過度或不足，并利于混合文庫以進行測序。最終文庫的 QC 可確保高質(zhì)量的制備，并可確定文庫的分子量、濃度和摩爾濃度。
 
安捷倫自動化電泳產(chǎn)品系列提供了多種用于核酸 QC 分析的儀器，包括生物分析儀系統(tǒng)、片段分析儀系統(tǒng)、TapeStation 系統(tǒng)和 Femto Pulse 系統(tǒng)。自動化電泳儀非常適合在整個 NGS 文庫制備過程中測定樣品的分子量大小、濃度和摩爾濃度，已在科學(xué)文獻中廣為引用。