中山大學中山醫(yī)學院梁思佳老師致力于代謝性心血管疾病，特別是高脂血癥誘導的心血管相關疾病致病機制的研究，系統(tǒng)研究心血管系統(tǒng)鈣池操縱性鈣通道和鈣激活氯通道在疾病中的病理學意義。近年來梁思佳老師在抗動脈粥樣硬化的潛在治療靶點的發(fā)現(xiàn)上取得重大進展，并在European Heart Journal（IF=35.86）上發(fā)表重要研究論文，表明 NFATc3可能是抗動脈粥樣硬化的潛在治療靶點，基于該研究論文中應用基因編輯小鼠模型研究NFATc3基因參與小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生機制的思路與策略，賽業(yè)生物首席科學家俞曉峰博士，對中山大學中山醫(yī)學院梁思佳老師進行了特邀專訪。
 

俞博士：我們知道，ApoE和Ldlr基因敲除（KO）是動脈粥樣硬化小鼠的常見疾病模型，梁老師的此研究項目中為什么會選擇NFATc3基因在冠狀動脈粥樣硬化致病作用機制開展如此深入探討研究，能否介紹一下其背后的理論及臨床方面的相關依據？

梁老師：我們團隊一直在圍繞離子通道與代謝性心血管疾病做系統(tǒng)的研究，其中在針對鈣信號與動脈粥樣硬化關系研究的前期工作中發(fā)現(xiàn)，鈣池操縱性鈣通道介導的鈣離子內流，可促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。有意思的是，該鈣信號的下游機制是通過激活Calcineurin-ASK1-MAPK信號發(fā)揮上述作用，而非通過經典的下游信號NFAT。恰恰相反，NFAT信號的激活加速了泡沫細胞的形成。我們通過對NFAT家族成員（NFATc1-4）之一的NFATc3表達量比較研究發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，NFATc3基因表達在臨床上動脈粥樣硬化患者人群中明顯降低。而在高脂飼養(yǎng)ApoE敲除小鼠誘導的動脈粥樣硬化疾病模型中也發(fā)現(xiàn)NFATc3基因表達呈現(xiàn)負相關。另外，非常值得注意的是，目前我們對器官移植患者的臨床監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，使用抑制NFAT信號的環(huán)孢霉素A等常用免疫抑制劑來發(fā)揮免疫抑制作用，進而誘發(fā)移植患者出現(xiàn)高脂血癥和動脈粥樣硬化等藥物副作用，已成為器官移植失敗導致死亡的最主要誘因。

關于上述免疫抑制劑應用中的不良反應，是否與抑制Calcineurin-NFAT有直接關聯(lián)，尚一無所知。因此，圍繞以上前期相關工作提示和臨床現(xiàn)象，我們關注了NFATc3基因的功能研究，并深入開展了后續(xù)的作用機制探討，這份工作首次闡明了NFATc3基因在動脈粥樣硬化致病過程中重要作用的關鍵因素，并揭示了在臨床免疫抑制劑應用中，誘發(fā)動脈粥樣硬化副作用的新機制。這份研究有望為今后提高心臟移植患者生存率，延長免疫抑制藥物作用時間，以及人工心臟使用壽命等治療方案的研究提供了臨床前動物實驗依據。

俞博士：梁老師在該研究中應用了NFATc3基因編輯小鼠疾病模型，探討與揭示該基因冠狀動脈粥樣硬化致病作用，為什么會選擇性將該基因在巨噬細胞中特異性敲除？

梁老師：我們知道巨噬細胞泡沫化是動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵因素，其在動脈粥樣硬化形成中的重要性，以及它們在斑塊內的富集，使巨噬細胞成為動脈粥樣硬化的有希望的治療靶點。 而且，我們在研究中發(fā)現(xiàn)NFATc3 表達在人和小鼠動脈粥樣硬化病變內的巨噬細胞中降低。這種表達水平的降低主要體現(xiàn)在巨噬細胞核內聚積的減少，且與臨床動脈粥樣硬化患者斑塊不穩(wěn)定性呈密切負相關。然而高脂等動脈粥樣硬化刺激對NFAT家族其他亞型在巨噬細胞細胞中的核定位并沒有顯著影響。因此，我們的工作把NFATc3主要聚焦在單核巨噬細胞功能調控上。

俞博士：在研究基因組織細胞特異性功能作用的時候，一般會采用條件性基因敲除（cKO），或者條件性過表達的策略構建相應小鼠模型，而梁老師在該研究中，不僅構建了該基因的cKO小鼠模型，為什么還要構建巨噬細胞特異性表達NFATc3基因小鼠模型？

梁老師：構建巨噬細胞特異性過表達NFATc3基因小鼠模型是為了探究巨噬細胞過表達NFATc3基因后，能否產生與巨噬細胞特異性敲除NFATc3相匹配的表型效應，從而去驗證NFATc3基因在動脈粥樣硬化進程中的關鍵作用。除此之外，我們還通過骨髓移植的方式，進一步去證明NFATc3在單核巨噬細胞中的關鍵作用。

俞博士：我注意到梁老師在冠狀動脈粥樣硬化小鼠疾病模型建立中，是采用在NFATc3基因巨噬細胞特異性敲除小鼠上，再導入AAV8-CD36-hPCSK9-D374Y (hPCSK9DY）突變體巨噬細胞特異性表達的策略，這是不是間接表明，NFATc3基因在小鼠巨噬細胞中敲除，需要加上hPCSK9DY條件性表達的協(xié)同作用，才能誘導小鼠形成冠狀動脈粥樣硬化的表型？如果采用NFATc3 cKO小鼠與ApoE/Ldlr KO交配的方式獲得雙基因敲除小鼠模型，是否也有可能開展類似致病作用機制的研究？

梁老師：我們在研究中發(fā)現(xiàn)，單純敲除或高表達巨噬細胞NFATc3不影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，也就說明巨噬細胞敲除NFATc3并不能自發(fā)動脈粥樣硬化。與絕大部分研究相似，這需要在ApoE/Ldlr 敲除背景下進行相關研究。PCSK9突變體誘導動脈粥樣硬化是近來年相關領域越來越常用的一種技術手段。PCSK9DY是前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9第374位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼岬墓δ塬@得性突變體，通過高效降解LDLR提高LDL-C水平，促進動脈粥樣硬化形成，其作用與Ldlr -/-小鼠誘導動脈粥樣硬化的原理相似。這種動脈粥樣硬化模型誘導方式可以極大節(jié)省基因修飾動物與ApoE/Ldlr敲除小鼠雜交所需時間，尤其是條件特異性表達小鼠。

俞博士：你們的研究揭示了NFATc3通過調節(jié)miR-204-5p/3p表達，分別抑制清道夫受體SR-A和CD36水平，達到防止泡沫細胞形成和冠狀動脈粥樣硬化的作用機制，該研究成果為深入開展冠狀動脈硬化作用機制方面的研究，以及臨床上該疾病的防治提供了哪些指導意義？

梁老師：我們認為從基礎研究角度來說，證明了NFATc3 / miR-204軸是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個關鍵因素。首次發(fā)現(xiàn)miR-204-3p特異性定位于巨噬細胞核中，通過抑制Ago2、H3K27ac和H3K4me3在CD36啟動子上的富集從而抑制CD36的轉錄，與miRNA靶向目標mRNA 3'-UTR經典調控機制極為不同。臨床指導意義上，揭示了環(huán)孢霉素A等免疫抑制劑誘發(fā)動脈粥樣硬化副作用的分子機理。但是，需要注意的是，考慮到對于器官移植患者而言，直接干預NFAT可能會同時影響免疫抑制效應，說明其下游關鍵調節(jié)因子miR-204可能是免疫抑制劑動脈粥樣硬化一個更為理想防治靶點，這也需要我們后續(xù)更深入的研究。

專家簡介
梁思佳，中山大學中山醫(yī)學院，副教授�，F(xiàn)任中國藥理學會心血管藥理專業(yè)委員會副秘書長，中國藥理學會心血管藥理青年委員會副主委，中國藥理學會生化與分子藥理學青年委員會委員。致力于代謝性心血管疾病發(fā)病，特別是高脂血癥誘導心血管疾病致病機制研究。近年來以第一或通訊作者在Eur Heart J、Adv Sci、ATVB等SCI雜志發(fā)表論著12篇，其中6篇IF>10，2篇IF>30。主持國家自然科學基金3項；申請國家發(fā)明專利2項；參編教材2部。

俞曉峰，賽業(yè)生物中國區(qū)副總裁兼首席科學家。軍事醫(yī)學科學院博士，國際知名模式動物和細胞生物學專家，耶魯大學醫(yī)學院和紐約大學醫(yī)學院研究員，美國基因打靶公司（iTL）和應用干細胞公司（ASC）資深科學家。在基因修飾模式動物領域有超過20多年研發(fā)與管理等方面的豐富經驗，在干細胞相關領域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在 Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol 等高水平雜志上。