近日，天木生物DREM cell設(shè)備助力中國農(nóng)大、清華大學完成蜜蜂腸道微生物單細胞高通量培養(yǎng)，實現(xiàn)菌株級別功能多樣性研究。
 
各種不同的生態(tài)系統(tǒng)都存在微生物群落，典型的微生物群落包括土壤、海洋或江湖等環(huán)境微生物以及人體或動物腸道微生物等。其中，腸道微生物群越來越引起人類的重視，越來越多的證據(jù)表明人體腸道微生物群的組成和活性變化與多種疾病和生態(tài)表型有關(guān)，如糖尿病、肥胖、結(jié)腸炎和嚴重抑郁癥等。因此，若研究腸道微生物與宿主的關(guān)系，則能夠更好地了解腸道共生體對疾病的作用機制，指導從腸道微生物角度出發(fā)的新的治療方法和策略的構(gòu)建，以達到治療或預(yù)防疾病的目的。
 
今年6月份，中國農(nóng)業(yè)大學的鄭浩團隊和清華大學的張翀團隊在 Microbiome 上發(fā)表了名為“Strain-level profiling with picodroplet microfluidic cultivation reveals host-specific adaption of honeybee gut symbionts”的研究論文，使用高通量皮升級液滴微流控細胞分選儀（DREM cell）開發(fā)基于液滴的微流控技術(shù)培養(yǎng)蜜蜂腸道微生物，驗證了微流控液滴平臺在腸道微生物培養(yǎng)組學中的可行性，為更復雜微生物群落的大規(guī)模研究鋪平了道路。
 
復雜微生物群由多種微生物組成，這些微生物是多物種復合體的一部分。盡管屬于同一屬和種的微生物擁有一個共同的、且對于細胞功能和物種的生存至關(guān)重要的核心基因組，但它們?nèi)匀粨碛邢喈敂?shù)量的菌株特異性基因，導致它們在生理和毒性特性等方面的不同表型，這些差異菌株可能會在不同程度上改變腸道微生物群的功能，進而影響到宿主健康。
 
因此鄭浩表示：僅在物種水平上研究微生物群落是不夠的，需要深入調(diào)查基因型和表型的多樣性。培養(yǎng)是微生物研究的基礎(chǔ)方法之一，但實際上由于培養(yǎng)條件的不適合，或是缺少互利共生的個體，很少有微生物可以在實驗室條件下輕松培養(yǎng)，對于復雜群落而言，往往也只能成功實現(xiàn)其中一部分占多數(shù)的，或快速生長菌株的有效表征，并且傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式通常是低通量的，豐富的菌株多樣性往往會在這個過程中被掩蓋。
 
幸運的是，越來越強大的測序技術(shù)出現(xiàn)了，該技術(shù)可更深入、更清楚地了解共生腸道微生物組的結(jié)構(gòu)、功能和多樣性。16S rRNA 基因測序（16S rRNA gene sequencing）和鳥槍法宏基因組測序（Shotgun metagenomic sequencing）是當前用于微生物群落分析的兩種主要工具。
 
16S rRNA 基因測序一般用于通過選擇性擴增和測序微生物 16S rRNA 基因的高變區(qū)來識別和分類微生物，可以通過相對少量的原始讀長來獲得有代表性的細菌分類學估計。其具有高通量，成本低的特點，并擁有相當多成熟的生物信息學工具。但這種方法的主要限制為分類群是根據(jù)基因組的單個區(qū)域的序列分配的，這導致了分辨率不足。此外，擴增引物的選擇也影響很大，一些引物已被證明會導致特定分類群的代表性過高或過低，這可能導致對分類單元的表示存在潛在偏差。
 
鳥槍法宏基因組測序對從整個微生物群落中分離出來的所有微生物的基因組進行測序。它的優(yōu)勢在于通過收集有關(guān)廣泛基因組區(qū)域的序列信息，能夠支持在物種水平上進行更準確的定義，提供更高的分類分辨率。同時還能支持進一步進行菌株水平的重建，得到新的基因或基因組，并對它們進行功能注釋和途徑預(yù)測以產(chǎn)生微生物群落的詳細描述。但這種方法成本較高，需要深度測序獲得更高的覆蓋度以達到令人滿意的分辨率，以及更復雜的下游分析。

“雖然基于測序的方法不限于可培養(yǎng)的微生物群，但 16S rRNA 基因測序方法在種內(nèi)分析的分辨率上仍然極其有限，并且可能會被每個基因組的 16S rRNA 基因的多個不同拷貝混淆，這同樣會造成對實際存在于環(huán)境中菌株功能的誤判；鳥槍法宏基因組測序通過考慮更多標記基因或全基因組來提供更多信息，目前也已經(jīng)開發(fā)了許多工具來分析宏基因組數(shù)據(jù)來解決這些問題，但來自取樣時間的或空間的偏差往往需要更深的測序深度來彌補，但這也帶來了急劇升高的成本。”鄭浩說道。
因此，若有一種培養(yǎng)方法可突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的局限，則會大大減輕測序技術(shù)的壓力�；�于液滴的微流控平臺或許是個不錯的選擇。

液滴微流控
微流控（Microfluidics）是指一種在微米尺度空間對流體進行操控的技術(shù)，在該技術(shù)下可以將化學、生物等實驗室的基本功能微縮到一個幾平方厘米芯片上，因此又被稱為“芯片實驗室”。作為微流控芯片研究中的重要分支，液滴微流控是一種在微尺度的通道內(nèi)利用流動剪切力或表面張力的改變，將兩種互不相溶流體中的離散相流體分割成納升級及以下體積的微液滴，并驅(qū)動微液滴運動對其進行操控的技術(shù)。

張翀表示：基于液滴微流控的特征，我們可以通過在直徑為數(shù)十至數(shù)百微米并由不混溶的油和工程表面活性劑分割的介質(zhì)液滴種劃分微生物來消除群落培養(yǎng)中過度生長的快速增長種群的影響。由于微制造的物理孔或通道不會限制液滴，因此可以快速創(chuàng)建數(shù)百萬個獨立的培養(yǎng)系統(tǒng)實現(xiàn)單個腸道微生物體的高通量培養(yǎng)。這極大克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的缺陷，為通過培養(yǎng)來表征來自腸道共生體的稀有類群提供了機會。

為了證明微流控液滴平臺在腸道微生物群研究中的可行性，鄭浩和張翀團隊將蜜蜂作為研究對象。原因是與其他動物相比，蜜蜂的腸道細菌簡單且穩(wěn)定，宏基因組分析也表明，雖然蜜蜂腸道由數(shù)量有限的細菌系統(tǒng)發(fā)育型組成，但仍然存在顯著的菌株水平多樣性，個別菌株具有獨特的基因組潛力和關(guān)鍵能力，這些能力在功能上與宿主的營養(yǎng)代謝和健康相關(guān)，為在菌株水平分析腸道共生體與宿主關(guān)系提供了很好的模型。

具體做法如下：首先，構(gòu)建了一個微流體液滴平臺，并產(chǎn)生了用蜜蜂腸道中的單個細菌細胞包裹的液滴；隨后，收集液滴并進行孵育培養(yǎng)，確定了液滴中微生物的生長能力，宏基因組分析揭示了與常規(guī)測序方法相比蜜蜂腸道更高的菌株水平多樣性，證明了微流體平臺在分離和富集稀有微生物菌株方面的潛力。
最后，結(jié)合分箱策略，得到了蜜蜂腸道微生物的大量基因組草圖，并進行了功能預(yù)測和比較基因組分析。對雙歧桿菌屬的分析揭示了潛在分類單元的存在，它們在跨膜運輸、肌醇利用以及多糖利用方面存在豐富的菌株多樣性。研究人員還得到了來自 Lactobacillus panisapium 的新菌株，該菌種在以往的研究中被認為特異性來源于中華蜜蜂；通過進一步的基因組比較，發(fā)現(xiàn)來自西方蜜蜂的菌株中獨特地含有一組與飲食阿拉伯糖利用相關(guān)的代謝基因簇，包括araf43A, rafB, abfA 和abfB，這可能與它對不同蜜蜂宿主的適應(yīng)密切相關(guān)。
 
“總體而言，結(jié)果證明了基于液滴的培養(yǎng)在研究蜜蜂腸道微生物多樣性方面的適應(yīng)性，同時這種方法也有潛力適用于其他復雜群落，在稀有類群的獲得以及功能鑒定方面發(fā)揮作用。”張翀說道。

他補充道，對于腸道微生物，當前的研究主要集中在特定培養(yǎng)基質(zhì)下的微流體液滴培養(yǎng)，結(jié)合 16s rRNA 擴增子測序以研究腸道微生物個體的膳食碳水化合物代謝或抗生素耐藥性。我們的研究則著重于通過隔離培養(yǎng)以富集在常規(guī)狀態(tài)下難以檢測的稀有類群，結(jié)合宏基因組的測序和分析，以較高通量實現(xiàn)對腸道稀有微生物的發(fā)現(xiàn)，以及代謝途徑和功能預(yù)測，提供關(guān)于宿主和腸道共生體關(guān)系的嶄新理解。

“未來，我們可能會通過調(diào)整液滴大小、改善培養(yǎng)條件和測序方法來研究腸道真核微生物，并實現(xiàn)對單胞的高通量識別，這將進一步擴大我們對腸道復雜成員的理解。同時，我們的流程也可以進一步應(yīng)用于人類腸道共生體的研究，擴展對人類腸道稀有類群以及它們與健康關(guān)系的認知和了解。” 研究團隊所使用的液滴微流控細胞分選儀（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技術(shù)開發(fā)的皮升級液滴微流控單細胞分選平臺，可將待篩選細胞進行包被形成單細胞微液滴，結(jié)合熒光篩選模型，可以在細胞水平完成微生物的高通量分離、培養(yǎng)、檢測、分選等。
高通量皮升級液滴單細胞分選系統(tǒng)（DREM cell）相比于傳統(tǒng)篩選方法，篩選效率可提升1萬倍，試劑消耗量可下降至百萬分之一，在篩選通量顯著提升的同時，單克隆篩選成本大幅度降低。該儀器不僅可廣泛應(yīng)用于細菌、酵母、動物細胞等的高通量篩選，還可以應(yīng)用于蛋白、核酸、抗體等生物大分子篩選等相關(guān)研究領(lǐng)域。