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8月23日19：00，由瑞沃德主辦的最-新一期「大成學(xué)堂」直播課程活動(dòng)如期開播。此次直播特邀南京大學(xué)張洋潯博士帶來(lái)“膜片鉗技術(shù)解析與經(jīng)驗(yàn)分享”主題分享，傾囊相授膜片鉗技術(shù)的理論知識(shí)和操作常見問(wèn)題。張洋潯博士細(xì)致入微的講解獲得觀眾們連連點(diǎn)贊！

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直播開始，張洋潯博士詳細(xì)介紹了膜片鉗技術(shù)的發(fā)展歷史及原理，緊接著以切身的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)來(lái)分享膜片鉗技術(shù)的整體系統(tǒng)組成及相應(yīng)的操作步驟，助力大家構(gòu)建對(duì)膜片鉗技術(shù)的整體認(rèn)知體系并了解每個(gè)必要步驟的重要作用。其中在介紹顯微操作系統(tǒng)時(shí)評(píng)價(jià)“瑞沃德自主研發(fā)的顯微操作系統(tǒng)，非常好用，容易上手”。

在第二部分，張洋潯博士通過(guò)結(jié)合所在課題組之前的研究工作，進(jìn)行了膜片鉗實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)分享，其中包括“觀察宏膜電流，并研究某種代謝性受體的下游離子機(jī)制”、“quantal Excitatory Postsynaptic Currents(qEPSC)”等等。
 

在第三部分，張洋潯博士分享了各個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的注意事項(xiàng)，例如“如何進(jìn)行玻璃微電極拉制”、“如何避免堵電極”、“如何排除干擾”等，引起評(píng)論區(qū)熱烈地討論。其中張博士贊嘆“瑞沃德自主研發(fā)的微電極拉制儀，使用起來(lái)非常方便”。
 

在答疑互動(dòng)環(huán)節(jié)，觀眾們紛紛提出自己在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題，眾多提問(wèn)迅速刷爆評(píng)論區(qū)：“達(dá)不到G歐封接時(shí)應(yīng)該排查哪些影響因素呢?”“單突觸和多突觸連接如何證明和區(qū)分呢？”“有哪些方法或操作可以避免記錄過(guò)程中細(xì)胞合上?”……足見膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的重要地位和科研小伙伴們對(duì)膜片鉗技術(shù)不斷求知和鉆研的精神。張洋潯博士也不遺余力地為大家進(jìn)行了解答，不僅在直播中在線解答了近20個(gè)問(wèn)題，還在直播后，對(duì)其他未回答的問(wèn)題進(jìn)行了整理和文字回復(fù)。咱就是說(shuō)，是不是超用心~
 

聊天區(qū)問(wèn)題詳解（文字版）

1、成像系統(tǒng)是用一般的顯微鏡嗎？放大倍數(shù)是多少？
答：顯微鏡就是普通的正置顯微鏡，有些型號(hào)的顯微鏡自帶放大一倍的功能。我們使用的低倍鏡是5倍鏡，高倍鏡是40倍鏡，常用鏡頭即可。此外不同的Camera和軟件對(duì)圖像處理的能力也不太一樣，會(huì)影響視覺(jué)效果。

2、電流鉗模式下如何維持膜電位穩(wěn)定，可以分享一下經(jīng)驗(yàn)嗎？
答：這個(gè)一般狀態(tài)比較好的細(xì)胞，它在電流鉗模式下記錄到的基線會(huì)很穩(wěn)定，一些前期波動(dòng)是因?yàn)殡姌O內(nèi)液交換所致，是正常的。如果該腦區(qū)存在自發(fā)放電，一般都能夠記錄到；有時(shí)候也有規(guī)律性的EPSP或IPSP，這也是正常的。如果你發(fā)現(xiàn)膜電位一直在動(dòng)，并且從負(fù)值跑到0或者正值，可能就是細(xì)胞狀態(tài)不對(duì)了，這也是一個(gè)正常的現(xiàn)象，沒(méi)有什么好的辦法可以操作；如果所有細(xì)胞都有這種現(xiàn)象，需考慮一下是否是電極內(nèi)液有問(wèn)題。此外，如果是一種周期性的浮動(dòng)，考慮一下要把液面調(diào)穩(wěn)，可能原因是出水口和進(jìn)水口的壓力不一致，使得液面波動(dòng)，換管子或者清理管子都能解決。此外，如果膜電位浮動(dòng)一些值能到穩(wěn)定狀態(tài)，可以用注射正或負(fù)電流方式，將細(xì)胞穩(wěn)定在你一直進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的膜電位上，因?yàn)檫@也是文獻(xiàn)描述的一種方法。

3、請(qǐng)問(wèn)一般細(xì)胞的封接時(shí)間可以維持多久，如達(dá)不到常見維持時(shí)間可能有哪些影響因素呢？
答：如果是吉?dú)W封接，一般成功后，稍過(guò)一會(huì)兒撤回正壓，基本不會(huì)掉。當(dāng)然得注意不能一直給負(fù)壓，那會(huì)將細(xì)胞一直吸入電極里面，影響記錄；如果是正常一個(gè)細(xì)胞能進(jìn)行多久實(shí)驗(yàn)的話，其實(shí)狀態(tài)非常好的細(xì)胞，包括各項(xiàng)設(shè)備和操作都正常，能記錄不止2個(gè)小時(shí)。我曾經(jīng)也請(qǐng)教師兄師姐，包括我自己也體會(huì)，就是遇到的那種狀態(tài)特別好的細(xì)胞，印象非常深刻的細(xì)胞也就那么幾個(gè)，當(dāng)然它們的數(shù)據(jù)也都在文章中的raw data示例圖里面；那其實(shí)我們能做的就是增加patch的次數(shù)，或者把關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)提到細(xì)胞狀態(tài)較好的前期來(lái)進(jìn)行，因?yàn)榧?xì)胞狀態(tài)由好到不好，是一個(gè)客觀存在的現(xiàn)象。

4、感覺(jué)腦片細(xì)胞破膜比培養(yǎng)細(xì)胞困難，有什么操作訣竅嗎？
答：我本身使用的是用嘴吸的方法破膜，如果你用的是注射器破膜可以考慮嘗試一下。就用1 ml注射器的外殼，嘴對(duì)著后面吸。但其實(shí)我覺(jué)得只要熟練操作，應(yīng)該就沒(méi)什么問(wèn)題，但需要練習(xí)。兩種細(xì)胞我都patch過(guò)，我覺(jué)得都沒(méi)什么很離譜的阻止破膜的因素。另外如果是因?yàn)榧獨(dú)W封接不正常所導(dǎo)致的吸破不成功，這也是正常的，還是需要吉?dú)W封接的成功。此外玻璃微電極的口徑很小的話，也會(huì)影響破膜，考慮用電阻3-5 MΩ的。

5、為了避免記錄過(guò)程中細(xì)胞合上（串聯(lián)電阻變大）破膜時(shí)或破膜后需要注意啥，或者有哪些特殊操作？
答：這個(gè)其實(shí)避免不了，咱們能做的就是長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)膜電容電流的形狀，如果變得矮胖了，Ra值變大了，我們就輕輕吸。當(dāng)然有時(shí)候會(huì)把細(xì)胞吸掉，這也不用灰心，總之多做就能熟能生巧。從另一方面來(lái)說(shuō)，關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)還是得快點(diǎn)做，因?yàn)樵酵�后面越難吸。

6、面對(duì)基線不穩(wěn)。常見的原因有哪些？（記錄電極充分鍍氯，使用的也是商業(yè)化的參考電極）答：第一可能是液面波動(dòng)較大所致，如果將記錄模式放到I = 0模式，電極入水，觀察一下記錄信號(hào)是否是有一定周期性變化。這個(gè)時(shí)候就需要考慮將水流和液面調(diào)穩(wěn)。第二，在patch完細(xì)胞以后，因?yàn)閮?nèi)液交換，導(dǎo)致基線變化是正常的，可以等穩(wěn)定再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一般5 min左右可以完成。如果基線在長(zhǎng)期一直變化（比如高于10 min），得考慮細(xì)胞狀態(tài)的原因?qū)е拢�這個(gè)時(shí)候不能猶豫，趕緊換下一個(gè)細(xì)胞。當(dāng)然基線變化在小范圍內(nèi)，其實(shí)都可以接受的。

7、 如何判斷steady state呢？
答：上述一些問(wèn)題問(wèn)了細(xì)胞基線不穩(wěn)定的狀態(tài)下怎么去調(diào)回穩(wěn)定狀態(tài)。如果是指機(jī)器穩(wěn)定狀態(tài)的話，我覺(jué)得就是沒(méi)有非常異常的干擾信號(hào)被你所記錄下來(lái)。如果有異�；蛘呓涣鳂幼兓�的電信號(hào)，就需要排干擾；如果是指細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)，就得看whole-cell recording狀態(tài)下，這個(gè)基線有沒(méi)有異常的波動(dòng)。一般吸破細(xì)胞，由于內(nèi)液交換，會(huì)使得基線變化，但是會(huì)穩(wěn)定在一個(gè)值上；除此之外的基線波動(dòng)，需要看看會(huì)不會(huì)對(duì)你記錄的電信號(hào)造成直接影響，再按照推理的方式進(jìn)行排除。細(xì)胞狀態(tài)由好變?yōu)椴缓�，其�?shí)也都屬于正常的，我們需要多patch，才能做完一個(gè)實(shí)驗(yàn)。

8、電極拉制后需要再處理電極嗎，例如酒精浸泡、超聲清洗之類的？
答：其實(shí)是很必要的。酒精浸泡、超聲清洗應(yīng)該發(fā)生在拉制電極之前，對(duì)所有的毛細(xì)玻璃管進(jìn)行該操作。之后拉制完電極，需要拋光這個(gè)操作，讓尖端更光滑，更易封接。如果有設(shè)備的話，可以進(jìn)行拋光操作；如果沒(méi)有的話，使用直接拉出來(lái)的玻璃微電極也可以。如果你買來(lái)的玻璃微電極拆開后非常干凈，其實(shí)就可以直接使用，之后要橫向保存在一個(gè)密閉環(huán)境，減少灰塵影響。長(zhǎng)期暴露的這種玻璃毛細(xì)管，就需要酒精浸泡、超聲清洗這些步驟。

9、每次換加熱片后拉制參數(shù)都要重新調(diào)試一遍嗎？
答：是的，都得跑一次ramp test或者軟化點(diǎn)測(cè)試（瑞沃德公司拉制儀），看看這個(gè)溫度點(diǎn)和你之前參數(shù)設(shè)置的大不大，不大的話就可以繼續(xù)使用原參數(shù)拉一根電極，看看口徑變化大不大。如果變化不大，可以依然使用原參數(shù)；如果變化很大，就得用測(cè)得的這個(gè)軟化點(diǎn)或者ramp test溫度來(lái)重調(diào)參數(shù)。

10、ACSF用前必須要校正pH嗎？
答：ACSF里面其實(shí)含有緩沖系統(tǒng)，外源性添加的東西一般不會(huì)影響整體。文獻(xiàn)中都說(shuō)pH 維持在7.2 ~ 7.4，只要照著他們給的配方配制，用正常純水或者雙蒸水，不太會(huì)出問(wèn)題。如果你們是用母液保存，使用的時(shí)候稀釋的方式進(jìn)行ACSF配制，這就需要對(duì)母液pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后對(duì)稀釋后的ACSF進(jìn)行pH評(píng)估，看pH會(huì)不會(huì)受到影響，心里得有個(gè)數(shù)。我使用的ACSF是現(xiàn)配現(xiàn)用，之前用pH計(jì)測(cè)過(guò)一次，其實(shí)在7.2左右，后面也就沒(méi)再測(cè)。只要實(shí)驗(yàn)條件不變，一般不會(huì)造成pH很大影響。

11、成年鼠取腦片不灌流影響很大嗎？
答：其實(shí)非常大。① 因?yàn)橛醒�的話，本身�?huì)對(duì)你的腦片透光性造成影響；② 其實(shí)并不是說(shuō)，不灌流就會(huì)導(dǎo)致patch不上細(xì)胞，不灌流可能會(huì)導(dǎo)致你切出來(lái)的腦片死的速率加快；你可能前幾張腦片能patch細(xì)胞，并也能記錄，但是后面腦片狀態(tài)容易很快變得不好。此外，細(xì)胞的活力本身也會(huì)受到影響，容易狀態(tài)不好。我之前遇到過(guò)的就是沒(méi)灌流好，結(jié)果在我那個(gè)腦區(qū)就看不見細(xì)胞。這里可以推薦你去jove上搜索patch clamp成年腦片制備相關(guān)的資料，他們做了對(duì)比，并且也描述目的是減少腦片受到缺氧的影響。

12、我們實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)微操的操作柄會(huì)引入很大的噪聲，不知道老師有沒(méi)有相應(yīng)的建議呢？
答：看看干擾是不是交流電，是的話就考慮用使用接地的方式，將其和這個(gè)膜片鉗防震臺(tái)一起接地，并且用錫紙給它包一層，看看能不能解決。如果是使用過(guò)程中會(huì)有相關(guān)的電流信號(hào)產(chǎn)生，就看看能不能用減少摩擦的方式。此外，還可以嘗試通過(guò)調(diào)low pass 或high pass看看能不能濾去這個(gè)噪聲。

13、請(qǐng)問(wèn)老師patch浦肯野細(xì)胞對(duì)于比較深的細(xì)胞您會(huì)去做嗎？我感覺(jué)正壓不能很好的吹干凈細(xì)胞表面。我的切片厚度是250um。做太深的細(xì)胞電極很容易堵。還有您在封接浦肯野細(xì)胞的時(shí)候holding是一步到位嗎？
答：我做的是成年浦肯野細(xì)胞，并且矢狀切，因?yàn)楣跔钋胁惶�容易區(qū)分相應(yīng)分區(qū)，而且我個(gè)人覺(jué)得得到的浦肯野細(xì)胞層不規(guī)則，影響視覺(jué)效果。此外，我patch過(guò)表面的和它后面一層的浦肯野細(xì)胞，因?yàn)榘�體巨大，下電極一般不能再把深層的浦肯野細(xì)胞暴露得很清楚。250 μm切片可以的，電極堵住可能并不是因?yàn)橄碌纳睿�是因�(yàn)檎龎禾�大把臟東西吹出來(lái)了，應(yīng)該注意電極內(nèi)液污染的事項(xiàng)。封接浦肯野細(xì)胞需要慢慢的holding，我這邊從0 mV開始，按照Δ -10 mV的變化直到鉗制目的電位，在每個(gè)電位變化下穩(wěn)定幾秒就行。我在封接時(shí)，用普通鉀離子內(nèi)液的確很難瞬間吉?dú)W封接，需要耐心等一會(huì)兒。

14、小白一枚，請(qǐng)問(wèn)有沒(méi)有推薦的入門書籍呢？
答：推薦劉振偉老師的《實(shí)用膜片鉗技術(shù)》；陳軍編的《膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。書中所描述的許多偏向物理，可以選自己能理解或者需要了解的去閱讀。另外有機(jī)會(huì)的話，還得去相關(guān)實(shí)驗(yàn)室去學(xué)習(xí)，手把手教學(xué)我個(gè)人還是覺(jué)得挺必須的。

15、請(qǐng)問(wèn)我的細(xì)胞破膜后IV刺激總掉或者不易破膜，是什么情況？
答：如果電流刺激或者電位變化過(guò)大，的確會(huì)造成細(xì)胞狀態(tài)不好。但是重要的實(shí)驗(yàn)還是得多做，總有穩(wěn)定的細(xì)胞被patch并被記錄到。有時(shí)候一個(gè)細(xì)胞就跑一個(gè)protocol的實(shí)驗(yàn)也可以，并不需要每個(gè)細(xì)胞都把所有實(shí)驗(yàn)的protocol都跑完。不破膜可能就是玻璃微電極電阻過(guò)大，口徑小。這種電極易于封接但不易吸破，考慮換口徑大一點(diǎn)，又和你目標(biāo)細(xì)胞相對(duì)合適的玻璃微電極進(jìn)行patch。

16、請(qǐng)問(wèn)記錄sIPSc時(shí)有的使用普通K內(nèi)液，鉗制0mvundefined  看文獻(xiàn)中類似的腦區(qū)細(xì)胞，有的用含Cs內(nèi)液-QX314，也是鉗制0mv ，會(huì)影響記錄結(jié)果嗎？
答：在記錄sIPSC時(shí)，如果鉗制在0 mV，用的內(nèi)液鉀成分是K-methylsulfate （140 mM）。如果鉗制在靜息電位下，用的可以是K+內(nèi)液，但是成分為KCl （135 mM），同時(shí)也是高氯的，一般老文獻(xiàn)會(huì)用這種配方；另外就是CsCl（110 mM）內(nèi)液加QX 314來(lái)阻斷動(dòng)作電位和K+通道。一般情況下建議，對(duì)于同一個(gè)課題內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，不要改變內(nèi)液的種類；更不能改變鉗制方法，因?yàn)閮煞N鉗制方法下的電化學(xué)梯度力不會(huì)完全一樣。

17、請(qǐng)問(wèn)原代神經(jīng)元為什么老是測(cè)不到誘發(fā)動(dòng)作電位？
答：我本身沒(méi)做過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但是我猜測(cè)原因可能是：①取原代神經(jīng)元應(yīng)該在鼠幼年未發(fā)育階段，這個(gè)時(shí)候本身細(xì)胞的電活動(dòng)就不會(huì)太強(qiáng)。我個(gè)人在幼鼠腦片上也不會(huì)很容易記錄到AP，基本上在成年動(dòng)物上才能穩(wěn)定記錄到；②你做的是原代細(xì)胞，也不是幼鼠的急性腦片，這就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周圍的環(huán)境勢(shì)必受到影響，也是不可忽視的因素。這個(gè)難度還是肯定有的，需要看看文獻(xiàn)的方法，借鑒別人用了什么特殊的內(nèi)液或外液。

18、請(qǐng)問(wèn)怎么確定自己吸住的是自己想要的單個(gè)通道呢？能介紹一下單通道記錄的經(jīng)驗(yàn)嗎?
答：我沒(méi)有做單個(gè)通道的實(shí)驗(yàn)�？磩e人文獻(xiàn)如果在腦組織細(xì)胞中分離某種通道的電流，也是在whole-cell recording下，用其他通道的阻斷劑以及可以激活該通道的電位protocol來(lái)分離該種通道的宏膜電流。在歷史上做單個(gè)通道實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，的確會(huì)有你提的這個(gè)問(wèn)題，解決方式可參考以下，在爪蟾卵母細(xì)胞上僅表達(dá)你目標(biāo)通道的基因，這樣你patch的膜上就僅有你這個(gè)通道蛋白，不會(huì)有別的通道；還有一種用人工的方法將離子通道和人造的脂雙層混合，形成脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

19、請(qǐng)問(wèn)膜片鉗注入的反向電流與平衡的電流時(shí)差有多少？注入的電流會(huì)否對(duì)細(xì)胞內(nèi)部離子的改變，影響后續(xù)的電生理記錄？
答：這個(gè)時(shí)差可以忽略不計(jì)的，假設(shè)你一次記錄有多個(gè)突觸傳遞信號(hào)，這些信號(hào)都和實(shí)際存在時(shí)差，所以相對(duì)而言這些突觸傳遞信號(hào)本質(zhì)是連續(xù)的。電壓鉗模式下，注入電流的目的是為了抵消某個(gè)鉗制電壓下的跨膜電流，所以對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，它胞內(nèi)和胞外的電荷沒(méi)變；Ag/AgCl電極以及電極內(nèi)液勢(shì)必會(huì)改變胞內(nèi)離子成分，這是客觀存在的，但對(duì)你記錄到的電信號(hào)來(lái)說(shuō)不會(huì)有任何影響。但需要知道電壓鉗狀態(tài)下的細(xì)胞已經(jīng)不是生理情況下的狀態(tài)，因?yàn)樗�的膜電位被鉗制住，不會(huì)再變化了。

20、分析曲線各種數(shù)據(jù)處理用什么軟件比較好呢？
答：平常還是用的Clampfit。對(duì)于突觸傳遞事件，我?guī)熜趾蛶熃阃扑]用mini analysis。

21、請(qǐng)問(wèn)老師做場(chǎng)電位嗎，想請(qǐng)教一下可以刺激出EPSP，但是誘導(dǎo)不出LTP是為什么呢？
答：能記錄到fEPSP就說(shuō)明整個(gè)系統(tǒng)沒(méi)什么問(wèn)題。誘發(fā)不出LTP來(lái)的原因可能是細(xì)胞狀態(tài)不太好。具體的話可以考慮這幾個(gè)方面：① ACSF通氧需要很充足；②電刺激調(diào)小一點(diǎn)，因?yàn)殚L(zhǎng)期記錄時(shí)，每20 s或30 s就要給一次電刺激，過(guò)大可能會(huì)導(dǎo)致突觸前遞質(zhì)消耗大于補(bǔ)充，可以參考文獻(xiàn)確定用多大的電刺激。此外LTP實(shí)驗(yàn)還是得多做，找到LTP表型明確的細(xì)胞。如果是別的沒(méi)有報(bào)道的腦區(qū)，LTP誘發(fā)實(shí)驗(yàn)可能更難誘發(fā)出來(lái)，但如果別人報(bào)道有，還是得增加信心一定能做出來(lái)。

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