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主題：腦刺激技術

• 經顱電刺激
• 經顱磁刺激
• 感覺刺激
• 深部腦刺激
• 光遺傳刺激

講師：周正

瑞沃德高級產品方案經理，專注于神經環(huán)路研究，在疼痛及漸凍癥模型制備，腦刺激/光纖記錄/在體電生理實驗上有著豐富的經驗，致力于為客戶提供專業(yè)的神經信號實驗方案。

主題：腦機接口技術

• 無創(chuàng)式腦機接口
• 半植入式腦機接口
• 全植入式腦機接口

講師：宋思賢

中國科學院大學碩士研究生，專注于腦機接口研究，特別是無創(chuàng)式腦機接口和全植入式腦機接口，研究方向主要為神經信號處理和環(huán)路解析。

上期直播間互動問題
這次我們全部為小伙伴解答

1. PCR實驗重復性很差是什么原因呢？
答：這個看是哪類重復性很差。
如果是同個批次內的復孔重復差，第一個主要原因：以加樣操作不準確導致，可以使用排槍或規(guī)范移液槍使用來減少操作誤差，還有需要定期對移液槍進行校準哦；第二個原因：儀器使用年限過長，PCR儀器的每個孔的溫度存在差異，這個需要檢修校準；第三個原因：模板濃度太低，樣品初始濃度越低,，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數。

如果是不同批次間的重復差，除卻以上原因，還存在試劑上的批次差異，應當減少試劑批次和種類的差異，盡量選擇同一生產商同一批次的產品進行。

2.請問我的標準曲線擴增不出來是怎么回事？
答：這個只能例舉一些情況，需要進行排查。首先可以使用一個明確知道是正常PCR體系（陽性對照）進行測試，這樣排查下是否是PCR試劑儀器等因素，第二，由于是標準曲線，標準樣DNA模板，用NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量儀檢查模板質量和濃度。

3.出現片狀拖帶該怎么解決呢？
答：首先出現片狀帶往往是因為PCR體系中DNA酶過量、鎂離子濃度過高或者退火溫度低，循環(huán)次數等原因造成，需要挨個排查，退火溫度可以通過設置退火溫度梯度去摸索其條件，往往需要提高退火溫度，PCR體系的問題可以適當減少PCR體系中酶、鎂離子的用量。循環(huán)次數可以適當減少也可以避免一些情況。這些條件都需要摸索。此外，也可能是DNA電泳的瓊脂糖凝膠問題，需仔細排查。

4.如何判斷假陰性或假陽性？
答：PCR實驗中，假陽性的發(fā)生率比假陰性的發(fā)生率要低，這是因為往往PCR引物設計時候是特異性高的引物，往往可以根據擴增條帶在DNA電泳下的條帶大小進行產物長度的判定來驗證，此外，排除假陽性的結果往往都是擴增產物進行測序驗證可以進一步論證其結果可靠性。

假陰性的結果就比較復雜了，一般會設計一個陽性對照實驗，來排除PCR體系中試劑本身失效或者PCR儀器帶來影響，然后還需要檢查實驗過程所使用DNA模板的情況，一般NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量儀檢查模板質量和濃度。

5.如何確定設置的PCR的體系是正確的呢?
答：設置陽性對照往往是一個不錯的選擇，可以檢查PCR體系中試劑（比如酶的活性）是否能正常使用。此外引物與模板情況，如果嚴謹，可以檢查引物與模板的質量和濃度，再者就是一個合適的退火溫度，可以設置溫度梯度進行PCR，然后DNA電泳后觀察條帶情況來進行選擇合適的退火溫度。最后就是確定擴增產物的正確性，是DNA電泳判讀擴增條帶長度是否準確，其次是膠回收進行擴增產物的測序驗證。

6.如何確定引物的濃度？
答：這個需要根據情況，引物合成公司會首先提供每個引物的原始儲存濃度，然后根據其濃度加入雙蒸去離子水稀釋，稀釋成PCR體系使用的濃度，然后就是換算問題，一般引物合成公司會給一個度量指標是OD，一般來說會附帶一個說明書，一般1OD是5nmol，也就是說加入500uL水后就是10umol/L，根據PCR體系推薦的引物摩爾數，計算1uL引物加入也就是10pmol的量，這塊往往這個根據PCR試劑盒會有推薦引物濃度（根據PCR體系不同進行調整）。

7.PCR擴出來的條帶亮度很弱，如何排查原因呢？
答：一般擴出來條帶是正確大小長度下還是很弱的亮度的話，往往是擴增效率不高，這個可以首先加入陽性對照，確保儀器和PCR試劑盒如酶是正常的。第二要考慮DNA模板的問題，先檢查模板質量和濃度，濃度過低條帶暗，濃度過高，PCR反應會受到抑制，擴增效率不高，還有DNA純度不高也會影響擴增效率。第三，退火溫度，這塊可以設置一個退火溫度梯度進行試驗，確定最佳退火溫度，最后，就是引物的問題，引物設計不太好，存在引物自身或引物間的互補配對情況。

8.如何設計引物，注意事項有哪些呢？
答：引物設計的原則非常多，需要考慮的因素很多，但是其最大的原則是特異性！

特異性：必須要保證引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

長度：一般引物長度在15-30bp，有時候可能因特殊原因50bp也可。

GC含量：一般40%-60%。

堿基隨機分布：引物堿基序列分布盡量隨機，不要連續(xù)很多個相同堿基。

引物的二級結果應當避免：引物自身、或者兩個引物間，盡量不要有互補結構。

引物的3′端必須高度保守：引物3′端務必與模版完全匹配，特別是最后一個堿基。這樣DNA酶才能順利匹配模板DNA進行復制延伸。

引物的5′端可以進行修飾：可以加入酶切位點，標記熒光、生物素等，也可以設計引入突變位點等情況。

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